ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 لوله جوش داده شده دوبلکس برای جزء شیمیایی صنایع شیمیایی، کمبود SPECC1L منجر به افزایش پایداری مفاصل متصل شده و کاهش ریزش سلول های تاج عصبی جمجمه می شود.

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.شما از یک نسخه مرورگر با پشتیبانی محدود CSS استفاده می کنید.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نشان می‌دهیم.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 لوله جوش داده شده دوبلکس برای صنایع شیمیایی

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.یک تولید کننده پیشرو است که در لوله های بدون درز فولاد ضد زنگ، لوله های آنیل شده روشن، لوله های سیم پیچ بدون درز و غیره متخصص است.به منظور تسهیل مشتریان، ما لوله ها و لوله ها را نیز جوش داده ایم.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.دارای پیشرفته ترین تجهیزات تولید و آزمایش است.ما کاملاً می توانیم نیاز شما را برآورده کنیم.طبق استاندارد بسیار دقیق ، لوله هایی که توسط ما تولید می شوند همیشه دارای تحمل OD و WT صحیح هستند.کنترل تحمل کاملاً مطابق با استانداردهای تولید است.محصولات ما همیشه از مشتریان راضی هستند.مشتریانی که محصولات ما را خریداری کردند سود بیشتری ایجاد کردند.
الف) OD (قطر بیرونی): 3.18mm تا 101.6mm
ب) WT (ضخامت دیوار): 0.5 میلی متر تا 20 میلی متر
ج) طول: با توجه به نیاز مشتری
د) استانداردها: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 و غیره
ه) روش فرآیند: ERW، EFW و غیره

اسلایدرهایی که سه مقاله را در هر اسلاید نشان می دهند.برای حرکت در اسلایدها از دکمه های پشت و بعدی استفاده کنید یا از دکمه های کنترلر اسلاید در انتها برای حرکت در هر اسلاید استفاده کنید.
سلول‌های تاج عصبی جمجمه (CNCC) از چین‌های عصبی جنینی جدا می‌شوند و به قوس‌های حلقی مهاجرت می‌کنند که بیشتر ساختارهای میانی صورت را تشکیل می‌دهند.اختلال عملکرد CNCC نقش مهمی در علت شکاف دهانی، یک ناهنجاری مادرزادی شایع دارد.جهش‌های هتروزیگوت SPECC1L در بیماران مبتلا به شکاف‌های آتیپیک و سندرمی یافت شده است.در اینجا، ما افزایش رنگ‌آمیزی اجزای اتصال چسب متعارف (AJ)، β-کاتنین و E-cadherin را در سلول‌های کشتار شده SPECC1L گزارش می‌کنیم، و میکروگراف‌های الکترونی انتشار آپیکال-پایه AJ را نشان می‌دهند.برای درک نقش SPECC1L در مورفوژنز کرانیوفسیال، ما یک مدل موش با کمبود Specc1l ایجاد کردیم.جهش یافته های هموزیگوت کشنده جنینی هستند و در بسته شدن لوله عصبی و لایه بندی CNCC دچار اختلال می شوند.رنگ آمیزی پروتئین AJ در چین های عصبی جهش یافته افزایش می یابد.این نقص AJ با نقص در لایه لایه شدن CNCC مطابقت دارد و نیاز به انحلال AJ دارد.علاوه بر این، جهش‌یافته‌های Speccc11 سیگنال‌دهی PI3K-AKT را کاهش داده و آپوپتوز را افزایش داده‌اند.در شرایط آزمایشگاهی، مهار خفیف سیگنال دهی PI3K-AKT در سلول های نوع وحشی برای ایجاد تغییرات AJ کافی بود.نکته مهم، تغییرات AJ ناشی از ناک داون SPECC1L را می توان با فعال کردن مسیر PI3K-AKT معکوس کرد.روی هم رفته، این داده ها نشان می دهد که SPECC1L، به عنوان یک تنظیم کننده جدید سیگنالینگ PI3K-AKT و زیست شناسی AJ، برای بسته شدن لوله عصبی و طبقه بندی CNCC مورد نیاز است.
سلول‌های تاج عصبی جمجمه‌ای (CNCCs) در نورواکتودرم پشتی قرار می‌گیرند و از طریق فرآیندی شامل انتقال اپیتلیال-مزانشیمی (EMT)1،2،3 از نوروپیتلیوم چین‌های عصبی در حال توسعه جدا می‌شوند.CNCC های اپیتلیال پیش از مهاجرت، اتصالات بین سلولی را مختل می کنند و تبدیل به CNCC های مزانشیمی در حال مهاجرت می شوند که قوس اول و دوم حلقی را پر می کنند و بیشتر غضروف جمجمه و صورت را تشکیل می دهند.بنابراین، ژن‌هایی که عملکرد CNCC را تنظیم می‌کنند، اغلب در علت ناهنجاری‌های مادرزادی جمجمه‌صورتی مانند شکاف‌های دهان و صورت مختل می‌شوند که معمولاً 1/800 تولد را تنها در ایالات متحده تحت تأثیر قرار می‌دهند.یکی از ناهنجاری های مادرزادی 8.
لایه لایه شدن CNCC همزمان با بسته شدن لوله عصبی قدامی بین 8.5 تا 9.5 روز از رشد جنینی در موش است.جهش‌های تعدادی از ژن‌های مرتبط با شکاف دهانی موش نیز نوعی نقص لوله عصبی از جمله Irf69،10، Ghrl310، Cfl111 و Pdgfrα12 را نشان می‌دهند.با این حال، فرآیندهای بسته شدن لوله عصبی و طبقه بندی CNCC را می توان مستقل در نظر گرفت، زیرا موش جهش یافته Splotch (Pax3) نقص هایی را در بسته شدن لوله عصبی بدون هیچ تأثیری بر طبقه بندی یا مهاجرت CNCC نشان می دهد.مدل‌های موش اضافی با نقص در تشریح CNCC و بسته شدن لوله عصبی به تشریح اساس مولکولی مشترک این دو فرآیند کمک می‌کنند.
جداسازی CNCC از سلول‌های عصبی اپیتلیال نیازمند انحلال اتصالات چسبنده (AJs) است که از کمپلکس‌های پروتئینی شامل E-cadherin، β-catenin، α-E-catenin و α-اکتینین مرتبط با رشته‌های اکتین تشکیل شده‌اند. مطالعات بیان بیش از حد E-cadherin در چین های عصبی کاهش یا تاخیر در لایه برداری CNCC را نشان داد.برعکس، سرکوب E-cadherin منجر به طبقه‌بندی اولیه می‌شود15،16.بسیاری از عواملی که واسطه EMT در طی لایه‌بندی CNCC می‌شوند، فاکتورهای رونویسی (AP2α، Id2، FOXD3، SNAIL، TWIST، SOX10) و پروتئین‌های بازسازی‌کننده ماتریکس خارج سلولی (ECM) مانند متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) هستند، با این حال CNCC‌ها اسکلت سلولی مستقیم AJ هستند. هنوز شناخته نشده است.مسیر PI3K-AKT برای مقابله با سطوح E-cadherin، عمدتاً از تحقیقات سرطان، شناخته شده است.مطالعات اخیر نشان داده است که از دست دادن سیگنالینگ PI3K-AKT مبتنی بر PDGFα در موش منجر به ناهنجاری های جمجمه-صورتی، از جمله شکاف کام و نقص لوله عصبی می شود.با این حال، رابطه بین مسیر PI3K-AKT و پایداری AJ بر طبقه بندی CNCC نامشخص است.
ما قبلاً SPECC1L را به عنوان اولین ژن جهش یافته در دو نفر با یک شکاف شدید که از دهان تا چشم گسترش می‌یابد، شناسایی کردیم که به نام شکاف مایل (ObFC) یا شکاف Tessier IV18 شناخته می‌شود.جهش های SPECC1L در دو خانواده چند نسلی با سندرم اتوزومال غالب Opitz G/BBB (OMIM #145410) شناسایی شده است، که در آن افراد مبتلا فاصله بیش از حد و شکاف لب/کام را نشان دادند و در یک خانواده با سندرم فاصله بیش از حد تیبی (OMIM#2014) .بیش از نیمی از موارد سندرم Opitz G/BBB با X مرتبط هستند (OMIM #300000) و ناشی از جهش در ژن MID1 است که پروتئین 22 اسکلت سلولی مرتبط با میکروتوبول را کد می کند.ما فرض می‌کنیم که SPECC1L، همچنین یک پروتئین مرتبط با میکروتوبول‌ها و اسکلت سلولی اکتین، ممکن است واسطه سیگنال‌دهی مورد نیاز برای بازسازی اسکلت سلولی اکتین در طول چسبندگی و مهاجرت سلولی باشد.از طریق مطالعات in vitro و in vivo، ما اکنون SPECC1L را به عنوان یک تنظیم‌کننده جدید پایداری AJ از طریق سیگنال‌دهی PI3K-AKT توصیف می‌کنیم.در سطح سلولی، کمبود SPECC1L منجر به کاهش سطح پروتئین pan-AKT و افزایش پراکندگی آپیکال-پایه AJ شد که با فعال‌سازی شیمیایی مسیر AKT حذف شد.در داخل بدن، جنین های دارای کمبود Specc11 اختلال در بسته شدن لوله عصبی و کاهش تشریح CNCC را نشان می دهند.بنابراین، SPECC1L در سیگنالینگ مبتنی بر چسبندگی سلولی بسیار تنظیم‌شده مورد نیاز برای عملکرد طبیعی CNCC در طول مورفوژنز صورت عمل می‌کند.
برای مشخص کردن نقش SPECC1L در سطح سلولی، ما از خط سلولی استئوسارکوم پایدار U2OS که قبلاً توضیح داده شد، با کمبود SPECC1L18 استفاده کردیم.این سلول‌های U2OS پایدار با حذف SPECC1L (kd) کاهش متوسط ​​(60-70٪) در سطوح رونوشت‌ها و پروتئین‌های SPECC1L، همراه با نقص در مهاجرت و سازماندهی مجدد اسکلت سلولی اکتین 18 داشتند. در مقابل، کاهش گذرا شدید در نشان داده شده است که SPECC1L منجر به نقص میتوزی می شود 23 .پس از شناسایی بیشتر، متوجه شدیم که سلول‌های SPECC1L-kd پایدار ما مورفولوژی را در درجه بالایی از تلاقی تغییر می‌دهند (شکل 1).سلول‌های کنترل منفرد و سلول‌های kd در تلاقی کم مشابه به نظر می‌رسند (شکل 1A,D).24 ساعت پس از ادغام، سلول های کنترل شکل مکعبی خود را حفظ کردند (شکل 1B، E)، در حالی که سلول های SPECC1L-kd دراز شدند (شکل 1C، F).میزان این تغییر در شکل سلول با تصویربرداری زنده در داخل بدن از سلول های کنترل و سلول های kd (فیلم 1) ثبت شد.برای تعیین نقش SPECC1L در سلولهای همریز، ابتدا بیان آن را بررسی کردیم.ما دریافتیم که سطوح پروتئین SPECC1L با همجوشی افزایش می یابد (شکل 1G)، در حالی که سطوح رونوشت SPECC1L افزایش نمی یابد (شکل 1H).علاوه بر این، با افزایش تراکم سلولی، پروتئین SPECC1L در مرزهای بین سلولی انباشته شد (شکل 2A-E)، با الگوی همپوشانی با الگوی β-کاتنین مرتبط با غشاء (شکل 2A'-E').با توجه به ارتباط SPECC1L با اسکلت سلولی اکتین 18،23، ما فرض کردیم که SPECC1L با اتصالات چسبنده مبتنی بر اکتین (AJ) تعامل دارد.
(AF) سلول های SPECC1L knockdown (DF) در محل تلاقی زیاد (F) در مقایسه با سلول های U2OS کنترل (AC) کشیده می شوند.در اینجا سه ​​نقطه از شش نقطه زمانی (T1، T3، T6) نشان داده شده است که ما برای تراکم سلول های مختلف انتخاب کردیم.(G) تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان می دهد که پروتئین SPECC1L در درجه بالایی از تلاقی در مقایسه با درجه پایین تلاقی در سلول های کنترل تثبیت شده است.وسترن بلات SPECC1L باند 120 کیلو دالتون مورد انتظار و باند وزن مولکولی بالاتر را نشان می دهد که احتمالاً پس از ترجمه اصلاح شده است (*).تجزیه و تحلیل وسترن بلات تحت شرایط یکسان برای تلاقی کم و زیاد انجام شد.تصاویری که SPECC1L را در تلاقی کم و زیاد نشان می دهد از همان بلات گرفته شده است.همان بلات برداشته شد و دوباره با آنتی بادی β-اکتین مورد بررسی قرار گرفت.(H) تجزیه و تحلیل کمی RT-PCR هیچ تغییر قابل توجهی در سطوح رونوشت SPECC1L نشان نداد.نوارهای خطا نشان دهنده SEMها از چهار آزمایش مستقل هستند.
(AE) ما شش نقطه زمانی (T1-T6) را انتخاب کردیم که نشان دهنده طیفی از تراکم سلولی برای عادی سازی تجزیه و تحلیل شکل سلول و تغییرات AJ در سلول های U2OS با ناک داون SPECC1L (kd) است.پنج نقطه اول از این نقاط زمانی شامل سلول های منفرد (T1)، ادغام 50-70٪ از خوشه های سلولی کوچک (T2)، ادغام بدون تغییر شکل سلول های kd (T3)، تغییر شکل سلول های kd (T4) و تغییرات 24 ساعته بود.در شکل خلفی سلول های kd (T5).پروتئین SPECC1L عمدتاً در سیتوپلاسم در T1 (A) پراکنده شد، اما تجمع آن در مرزهای بین سلولی در نقاط زمانی بعدی (B-E، فلش) مشاهده شد.(FJ) β-کاتنین تجمع مشابهی را در مرزهای بین سلولی مرتبط با کمپلکس AJ نشان می دهد.(A'-E') SPECC1L و β-کاتنین رنگ آمیزی همپوشانی را در مرزهای سلولی در تراکم سلولی بالا نشان می دهند (فلش).(F'-J') در سلول های SPECC1L-kd، رنگ آمیزی β-کاتنین در تراکم سلولی کم (F'-H') طبیعی به نظر می رسد، اما با تغییر شکل سلول گسترش می یابد (I', J'؛ فلش ها)، که نشان می دهد AJ تغییر کرده اند.میله ها = 10 میکرومتر
سپس سعی کردیم اثر کمبود SPECC1L را بر AJ تعیین کنیم.ما از چندین نشانگر مرتبط با AJ، از جمله اجزای متعارف F-actin، myosin IIb، β-catenin و E-cadherin24،25،26،27 استفاده کردیم.فیبرهای استرس اکتین در سلول های SPECC1L-kd همانطور که قبلا توضیح داده شد افزایش یافت (شکل 3A,B) 18.میوزین IIb مرتبط با رشته های اکتین افزایش مشابهی را در سلول های SPECC1L-kd در شرایط آزمایشگاهی نشان داد (شکل 3C,D).β-کاتنین مرتبط با AJ به کادهرین در غشای سلولی متصل می‌شود و یک الگوی بیانی طبیعی "لانه زنبوری" را در مکعب‌های کنترل نشان می‌دهد (شکل 3E,G).جالب توجه است، در تصاویر مسطح با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال، رنگ آمیزی β-کاتنین (شکل 3E,F) و E-cadherin (شکل 3G,H) بر روی غشای سلولی سلول های دارای کمبود SPECC1L، الگوهای برجسته ای از رنگ آمیزی طولانی را نشان داد.این گسترش رنگ آمیزی بتا کاتنین مرتبط با AJ در سلول های kd در محل تلاقی بارزتر بود، اما به نظر می رسید که قبل از تغییرات در شکل سلول باشد (شکل 2F-J، F'-J').برای تعیین ماهیت فیزیکی این رنگ آمیزی AJ گسترده، ما مرزهای سلولی را در سطح آپیکال-پایه سلول های SPECC1L-kd U2OS با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) بررسی کردیم (شکل 3I,J).برخلاف سلول‌های کنترل (شکل 3I)، که دارای نواحی متراکم الکترونی جداگانه نشان‌دهنده AJ (فلش‌ها) بودند، سلول‌های kd (شکل 3J) مناطق بزرگ و پیوسته‌ای با چگالی الکترونی بالا نشان‌دهنده AJ در امتداد صفحه آپیکوبازال نشان دادند..علاوه بر این، در مقاطع عرضی، چین‌های غشای سلولی گسترده‌ای را در سلول‌های kd مشاهده کردیم (شکل S1A، B)، که الگوی گسترش یافته نوارهای رنگ‌آمیزی β-کاتنین و E-cadherin را توضیح می‌دهد (شکل 3F، H).در حمایت از نقش SPECC1L در AJs، β-کاتنین با SPECC1L در لیز سلول‌های U2OS هم‌ریز به صورت همزمان رسوب ایمنی شد (شکل 3K).همراه با رنگ آمیزی ایمنی طولانی برای نشانگرهای AJ، تجزیه و تحلیل TEM با فرضیه ما که کمبود SPECC1L تراکم و واریانس آپیکال-پایه AJ را افزایش می دهد، سازگار بود.
(AH) افزایش رنگ‌آمیزی F-اکتین در سلول‌های kd در 48 ساعت پس از همجوشی (T6؛ A, B).تغییر رنگ آمیزی میوزین IIb مرتبط با F-اکتین (C, D).الگوی صاف رنگ‌آمیزی غشای β-کاتنین و E-کادهرین در سلول‌های کنترل (E، G) در سلول‌های SPECC1L-kd (F، H) افزایش یافت.میله ها = 10 میکرومتر(I-J) میکروگراف های الکترونی با مشاهده اتصال بین سلولی آپیکال-پایه.سلول‌های کنترل، نواحی متراکم الکترونی متمایز را نشان می‌دهند که نشان‌دهنده اتصالات چسبنده است (I، فلش).در مقابل، کل اتصال آپیکال-پایه در سلول‌های SPECC1L-kd به نظر الکترونی متراکم (J، فلش) می‌رسد که نشان‌دهنده افزایش چگالی و پراکندگی اتصالات چسبنده است.(K) β-کاتنین با SPECC1L در لیزهای سلولی U2OS به هم ریخته شد.تصویر گرفته شده از یک نقطه نشان دهنده یکی از چهار آزمایش مستقل است.
برای درک نقش SPECC1L در مورفوژنز کرانیوفسیال، ما یک مدل موش با کمبود Spec1l را با استفاده از دو رده سلولی مستقل ES تله، DTM096 و RRH048 (BayGenomics، CA) ایجاد کردیم که نشان‌دهنده رونوشت‌های اینترون 1 و Specc1l هستند که در 15 ثبت شده‌اند (شکل). .4A، شکل S2).مکان ژنومی درج ناقل طعمه با توالی یابی کل ژنوم تعیین شد و با PCR تایید شد (شکل S2).هر دو طرح تله ژنی همچنین امکان ادغام درون قاب خبرنگاران Specc11-lacZ را پس از ضبط فراهم کردند.بنابراین، بیان lacZ تعیین شده توسط رنگ آمیزی X-gal به عنوان شاخص بیان Speccc11 استفاده شد.هر دو آلل الگوهای بیان lacZ مشابهی را نشان دادند، با تله ژن DTM096 در اینترون 1 بیان قوی تری نسبت به RRH048 در اینترون 15 نشان داد (نشان داده نشده است).با این حال، Spec1l به طور گسترده بیان می‌شود، با بیانی خاص در چین‌های عصبی در E8.5 (شکل 4B)، در لوله عصبی و فرآیندهای صورت در E9.5 و E10.5 (شکل 4C,D)، و در اندام‌های در حال رشد. در E10.5 و چشم (شکل 4D).ما قبلاً گزارش داده‌ایم که بیان SPECC1L در قوس اول حلقی در E10.5 در اپیتلیوم و مزانشیم زیرین وجود دارد که مطابق با اصل و نسب CNCC است.برای آزمایش بیان SPECC1L در CNCC، چین‌های عصبی E8.5 (شکل 4E-J) و بخش‌های جمجمه E9.5 (شکل 4K-) را انجام دادیم.در E8.5، SPECC1L چین های عصبی را به شدت رنگ آمیزی کرد (شکل 4E، H)، از جمله سلول های رنگ آمیزی شده با نشانگرهای NCC (شکل 4G، J).در E9.5، SPECC1L (شکل 4K، N) CNCC مهاجر به شدت رنگ آمیزی شده با AP2A (شکل 4L، M) یا SOX10 (شکل 4O، P) رنگ آمیزی شد.
(الف) نمایش شماتیک ژن Specc11 موش نشان دهنده درج ناقل طعمه در کلون های سلولی ES DTM096 (اینترون 1) و RRH048 (اینترون 15).(BD) رنگ‌آمیزی lacZ جنین‌های هتروزیگوت Speccc1lDTM096 که بیانگر بیان Speccc1l از E8.5 تا E10.5 است.NE = نورواکتودرم، NF = چین عصبی، PA1 = اولین قوس حلقی.(EP) رنگ‌آمیزی SPECC1L با نشانگرهای NCC AP2A و SOX10 در چین‌های عصبی E8.5 (NF؛ EJ) و بخش‌های جمجمه E9.5 (KP).رنگ‌آمیزی SPECC1L به‌طور گسترده در چین‌های عصبی E8.5 (E, H؛ سر پیکان)، از جمله سلول‌های برچسب‌گذاری شده با AP2A (F, G؛ سر پیکان) و SOX10 (I, J؛ سر پیکان) مشاهده شد.در E9.5، SPECC1L به شدت CNCCهای مهاجر (K، N؛ فلش) با برچسب AP2A (L، M؛ فلش) و SOX10 (O، P؛ فلش) را رنگ آمیزی کرد.
تلاقی بین موش‌های هتروزیگوت Spec1lDTM096/+ و Spec1lRRH048/+ نشان می‌دهد که دو آلل تله ژن مکمل هم نیستند و هتروزیگوت‌های ترکیبی و هموزیگوت‌های جنینی برای هر یک از آلل‌های تله ژنی کشنده جنینی هستند (جدول S1).نسبت های مندلی نشان دهنده کاهش نرخ بقای هتروزیگوت ها در بدو تولد بود (انتظار می رود 1.34 در مقابل 2.0).ما به مرگ و میر پری ناتال کم در بین هتروزیگوت ها اشاره کردیم، برخی ناهنجاری های جمجمه-صورتی داشتند (شکل S3).با این حال، نفوذ کم این فنوتیپ های جمجمه-صورتی پری ناتال، مطالعه مکانیسم های پاتوفیزیولوژیک زمینه ای آنها را دشوار می کند.بنابراین، ما بر روی فنوتیپ کشنده جنینی جهش‌یافته Specc11 هموزیگوت تمرکز کردیم.
بیشتر جنین های جهش یافته هتروزیگوت یا هموزیگوت Specc1lDTM096/RRH048 پس از E9.5-10.5 (شکل های 5A-D) رشد نکردند، و لوله عصبی از جلو بسته نشد (شکل 5B، D) و گاهی اوقات از عقب بسته نشد (نشان داده نشده است). ..این نقص بسته شدن لوله عصبی جمجمه با اکثریت DLX2 با علامت CNCC که در چین‌های عصبی در E10.5 باقی می‌مانند مرتبط بود، که نشان‌دهنده عدم تشریح است (شکل 5A'-D').برای تعیین اینکه آیا اندازه کلی CNCC نیز کاهش یافته است، ما خطوط CNCC را با GFP در خطوط تله ژنی خود با Wnt1-Cre و ROSAmTmG برچسب گذاری کردیم.ما GFP+ NCC و GFP- (RFP+) non-NCC را از کل جنین مرتب کردیم.در E9.5، نسبت CNCC های نشاندار شده با GFP مرتب شده با جریان به طور قابل توجهی بین WT و جنین های جهش یافته (نشان داده نشده) تغییر نکرد، که نشان دهنده مشخصات CNCC طبیعی است.بنابراین، ما فرض کردیم که رنگ‌آمیزی باقی‌مانده Wnt1-Cre و DLX2 در چین‌های عصبی در معرض (شکل 5B') به دلیل لایه‌بندی معیوب CNCC است، احتمالاً به دلیل افزایش تراکم یا پراکندگی سلول‌های AJ، همانطور که در سلول‌های SPECC1L-kd دیده می‌شود.ما از نشانگرهای NCC SOX10، AP2A و DLX2 برای تأیید وجود CNCC در چین عصبی استفاده کردیم (شکل 5E-R).در E8.5، رنگ‌آمیزی چین‌های عصبی برای هر سه نشانگر NCC در بخش‌های WT (شکل 5E, G, I) و جهش یافته Specc1l (شکل 5F, H, J) مشاهده شد.در E9.5، در حالی که نشانگرهای NCC NCC مهاجر را در مقاطع WT رنگ آمیزی می کردند (شکل 5M، O، Q)، رنگ آمیزی NCC باقیمانده در چین های عصبی در معرض جنین های جهش یافته Specc1l مشاهده شد (شکل 5N، P، R).از آنجایی که SOX10 و DLX2 CNCC های مهاجرتی را نشان می دهند، این نتیجه نشان می دهد که CNCC های دارای کمبود SPECC1L به مشخصات پس از مهاجرت دست می یابند اما از چین های عصبی مهاجرت نمی کنند.
کمبود Speccc11 منجر به بسته شدن لوله عصبی معیوب، لایه لایه شدن سلول های کرست عصبی جمجمه و AJ می شود.
(A, B') E9.5 WT (A) جنین حامل سلول‌های تاج عصبی جمجمه در حال مهاجرت (CNCC) با برچسب Wnt1-Cre (A').در مقابل، جنین های جهش یافته Speccc11 چین های عصبی باز (B)، سر پیکان ها و CNCC هایی را نشان می دهند که مهاجرت نکرده اند (B'، نوک پیکان).(C، D') تصاویر میدان روشن (C، D') و رنگ آمیزی ایمنی (C'، D') نشانگر CNCC DLX2 جنین های E10.5 WT (C، C') و Specc1l (D، D').در جنین های WT E10.5، CNCC با DLX2 مثبت، قوس های آبشش (C'، فلش) را مستعمره می کند، در حالی که در جهش یافته ها، رنگ آمیزی آشکار در چین های عصبی باز (D'، فلش ها) و در اولین قوس های حلقی (D') ادامه دارد. فلش ها).) با مقداری رنگ‌آمیزی (فلش‌ها) که نشان‌دهنده لایه‌برداری ضعیف و مهاجرت CNCC است.ER) بخش هایی از جنین های جهش یافته WT و Spec1l در مراحل E8.5 (E-L) و E9.5 (M-R) با نشانگرهای NCC SOX10 (E، F، M، N)، AP2A (G، H، O, P ) و DLX2 (I, J, Q, R).در E8.5، رنگ‌آمیزی NCC در بخش‌های عصبی نوع وحشی (NF) و بخش‌های جهش یافته مشاهده شد.رنگ آمیزی مشترک SOX10 و β-کاتنین در E8.5 WT (K) و جهش یافته (L) افزایش رنگ آمیزی β-کاتنین را در مرزهای سلولی در چین های عصبی نشان داد.در E9.5، رنگ‌آمیزی نوع وحشی CNCC‌های مهاجر (M، O، Q) مشاهده شد، در حالی که در جهش‌یافته‌ها، CNCC‌های طبقه‌بندی نشده چین‌های عصبی باز (N، P، R) را رنگ‌آمیزی کردند.(S-Z) تجزیه و تحلیل برچسب‌گذاری AJ در داخل بدن در بخش‌های تاجی جنین‌های WT و Specc11DTM096/RRH048 با جهش E9.5.یک صفحه مقطع تقریبی در گوشه سمت راست بالا نشان داده شده است.در برش های بافت جهش یافته، افزایش رنگ آمیزی F-اکتین (S، T) و میوزین IIb (U، V) مشاهده شد.مشابه نتایج آزمایشگاهی در شکل 3، در جنین های جهش یافته، افزایش رنگ آمیزی غشایی برای β-کاتنین (W, X) و E-cadherin (Y, Z) مشاهده شد.(AA-BB) یک میکروگراف الکترونی از یک بخش از جنین نوع وحشی که به فراتر از مرز سلول آپیکال-پایه نگاه می کند، یک ناحیه متراکم الکترونی متمایز را نشان می دهد که نشان دهنده اتصالات چسبنده است (AA، فلش).در مقابل، در بخش‌هایی از جنین‌های جهش‌یافته Specc11 (BB، فلش)، کل محل اتصال آپیکوبازال الکترونی متراکم است، که نشان‌دهنده افزایش تراکم و پراکندگی اتصالات چسبنده است.
برای آزمایش این فرضیه که کاهش لایه‌بندی به دلیل تغییر AJ است، برچسب‌گذاری AJ را در چین‌های عصبی در معرض جنین‌های جهش یافته Specc1l بررسی کردیم (شکل 5S-Z).ما افزایشی در فیبرهای استرس اکتین (شکل 5S، T) و افزایش همزمان افزایش محلی شدن رنگ آمیزی میوزین IIB روی الیاف اکتین مشاهده کردیم (شکل 5U، V).نکته مهم، ما افزایش رنگ آمیزی β-کاتنین (شکل 5W,X) و E-cadherin (شکل 5Y,Z) را در مرزهای بین سلولی مشاهده کردیم.ما همچنین رنگ آمیزی β-کاتنین NCC را در چین های عصبی جنین های E8.5 بررسی کردیم (شکل 5K، L).رنگ آمیزی β-کاتنین در چین های عصبی جهش یافته Specc1l قوی تر به نظر می رسد (شکل 5L و K)، که نشان می دهد تغییرات AJ آغاز شده است.در میکروگراف های الکترونی مقاطع جمجمه جنین های E9.5، ما دوباره افزایش رنگ آمیزی الکترونی متراکم را در جنین های جهش یافته Specc1l در مقایسه با WT مشاهده کردیم (شکل 5AA، BB و S1E-H).در مجموع، این نتایج از نتایج آزمایشگاهی ما در سلول‌های SPECC1L-kd U2OS پشتیبانی می‌کنند و نشان می‌دهند که رنگ‌آمیزی نابجای AJ مقدم بر طبقه‌بندی CNCC در جنین‌های جهش‌یافته ما است.
با توجه به رابطه آنتاگونیستی شناخته شده بین فعالیت AKT و پایداری E-cadherin، 17،28 ما دخالت سیگنالینگ PI3K-AKT را فرض کردیم.علاوه بر این، ما تاول های زیر اپیدرمی را در برخی از جنین های جهش یافته خود مشاهده کردیم که از کشندگی (<5٪) در E9.5-10.5 فرار کردند و در عوض در حدود E13.5 قرار گرفتند (شکل S3).وزیکول های ساب اپیدرمی نشانه کاهش سیگنالینگ PI3K-AKT بر اساس PDGFRα12 هستند.Fantauzzo و همکاران(2014) گزارش داد که اختلال در فعال سازی PI3K مبتنی بر PDGFRα در جنین های جهش یافته PdgfraPI3K/PI3K منجر به وزیکول های زیر اپیدرمی، نقص لوله عصبی و فنوتیپ های شکاف کام می شود.در واقع، سطوح pan-AKT و Ser473-AKT فسفریله فعال in vivo در بافت‌های جهش یافته Speccc1l به توقف جنینی E9.5 کاهش یافت (شکل 6A-D).کاهش سطوح Ser473-AKT فسفریله ممکن است کاملاً به دلیل کاهش سطوح pan-AKT در داخل بدن (شکل 6E) و در شرایط آزمایشگاهی (شکل 6F) باشد.کاهش در شرایط آزمایشگاهی تنها زمانی مشاهده شد که سلول‌های U2OS به شدت با تغییرات شکل سلولی و تراکم AJ همخوانی داشتند (شکل 6D).بنابراین، داده‌های ما نشان می‌دهد که SPECC1L یک تنظیم‌کننده مثبت جدید سیگنال‌دهی PI3K-AKT در مورفوژنز کرانیوفسیال است.
(A-E) E8.5 (A,B) و E9.5 (C,D) مقاطع جمجمه یا لیزات E9.5 از جنین های جهش یافته Speccc1l (E) که سطوح S473-AKT فسفریله فعال و کاهش پروتئین pan-AKT را نشان می دهد. ، در مقایسه با کنترل WT.وسترن بلات بر روی لیزهای نوع وحشی و لیزهای جهش یافته در شرایط یکسان انجام شد.تصاویر نشان داده شده برای SPECC1L از یک بلات گرفته شده است.همان بلات برداشته شد و مجدداً با آنتی بادی های آنتی پان-ACT و β-اکتین مورد بررسی قرار گرفت.سطوح Pan-AKT در چین‌های عصبی E8.5 (A، B) و سطوح S473-AKT فسفریله در بخش‌های جمجمه E9.5 به طور قابل‌توجهی کاهش یافت.(F) سطوح Pan-AKT به طور مشابه در lysates سلول های SPECC1L-kd U2OS برداشت شده در تلاقی بالا کاهش یافت.نوارهای خطا نشان دهنده SEMها از سه کمیت وسترن بلات مستقل هستند.(GJ) بخش‌هایی از جنین‌های WT در E9.5 به ترتیب با KI67 و کاسپاز شکافته شده 3 رنگ‌آمیزی شدند که تکثیر سلولی (G، G') و فعالیت آپوپتوز کمی (H، H') را نشان می‌دهند.جنین های جهش یافته Speccc11 تکثیر سلولی قابل مقایسه ای را نشان می دهند (I)، اما تعداد سلول هایی که تحت آپوپتوز قرار می گیرند به طور قابل توجهی افزایش می یابد (J).
سپس نشانگرهای تکثیر و آپوپتوز را بررسی کردیم.ما هیچ تفاوتی در تکثیر جنین های E9.5 مشاهده نکردیم (شکل 6E، G در مقایسه با I) با شاخص تکثیر 82.5 درصد برای جهش یافته های WT و 86.5 درصد برای جهش یافته های Specc1l که با رنگ آمیزی KI67 اندازه گیری شد (P <0.56، Fisher's تست دقیق).به طور مشابه، ما هیچ تفاوتی در آپوپتوز اندازه‌گیری شده با رنگ‌آمیزی برای کاسپاز بریده شده 3 در چین‌های عصبی در E8.5 تا زمان توقف جنین (نشان داده نشده) (نشان داده نشده) مشاهده نکردیم.در مقابل، آپوپتوز به طور قابل توجهی در تمام جنین های جهش یافته E9.5 افزایش یافت (شکل 6F، H و J).این افزایش کلی در آپوپتوز با کاهش سیگنال دهی PI3K-AKT و مرگ و میر اولیه جنینی مطابقت دارد29،30،31.
در مرحله بعد، برای تایید نقش علی برای سیگنال دهی PI3K-AKT در تغییرات AJ در سلول های kd ما، مسیر سلول های کنترل و kd را به صورت شیمیایی تغییر دادیم (شکل 7A-F).ما به عنوان نشانگر از فنوتیپ تغییر شکل سلول مشاهده شده در سلول های SPECC1L-kd همرو استفاده کردیم، که با استفاده از نسبت طولانی ترین بعد (طول) به بعد عمودی مربوطه (عرض) مقدار آن را تعیین کردیم.نسبت 1 برای سلول های نسبتا گرد یا مکعبی انتظار می رود (شکل 7G).علاوه بر شکل سلولی، ما همچنین اثر روی AJ را با رنگ آمیزی β-کاتنین تأیید کردیم (شکل 7A'-F').مهار مسیر PI3K-AKT با استفاده از ورتماننین برای تغییر شکل سلول در سلول های کنترل (شکل 7A,C) و AJ (شکل 7A') کافی بود.فعال کننده PI3K-AKT SC-79 بر شکل سلول (شکل 7A, E) یا گسترش AJ (شکل 7A') در سلول های کنترل تأثیری نداشت.در سلول‌های SPECC1L-kd، سرکوب بیشتر مسیر PI3K-AKT منجر به افزایش آپوپتوز (شکل 7B، D) و افزایش قابل توجه رنگ‌آمیزی β-کاتنین (شکل 7B')، مطابق با جهش‌های سنگین in vivo ما شد.مهمتر از همه، فعال شدن مسیر PI3K-AKT شکل سلولی (شکل 7B,F) و فنوتیپ AJ (شکل 7B) را به طور قابل توجهی بهبود بخشید.تغییرات در شکل سلول به عنوان نسبت گردی سلول (CCR) اندازه‌گیری شد و از نظر اهمیت همانطور که در بالا توضیح داده شد مقایسه شد (شکل 7G).در واقع، در سلول‌های کنترل (شکل 7G، CCR = 1.56)، تیمار ورتمانین برای تغییر قابل توجه شکل سلول کافی بود (شکل 7G، CCR = 3.61، p <2.4 × 10-9) تا حدی مشابه آنچه مشاهده شد. در SPECC1L.سلول -kd (شکل 7G، CCR = 3.46).تیمار ورتمانین سلول‌های SPECC1L-kd (شکل 7G، CCR = 3.60، ناچیز) از سلول‌های kd تیمار نشده (شکل 7G، CCR = 3.46، ناچیز) یا سلول‌های کنترل تیمار شده با ورتمانین (شکل 7G) مهم‌تر نبود.، CCR = 3.46، ناچیز) به علاوه بر افزایش طول سلول تأثیر می گذارد (7G، CCR = 3.61، ناچیز).مهمتر از همه، فعال کننده SC-79 AKT فنوتیپ دراز سلول های SPECC1L-kd را بازیابی کرد (شکل 7G، CCR = 1.74، p <6.2 × 10-12).این نتایج تأیید می کند که SPECC1L سیگنالینگ PI3K-AKT را تنظیم می کند و نشان می دهد که کاهش متوسط ​​در SPECC1L بر چسبندگی سلول تأثیر می گذارد، در حالی که کاهش شدید منجر به آپوپتوز می شود (شکل 8).
(A-F') سلول های کنترل (A, C, E) و SPECC1L-kd (B, D, F) تحت درمان با مهارکننده مسیر PI3K-AKT ورتمانین (C, D) یا فعال کننده SC-79 (E, F) سلول های کنترل درمان نشده مکعبی (A) با رنگ آمیزی سلولی β-گربه طبیعی (A') هستند، در حالی که سلول های kd دراز هستند (B) با افزایش رنگ آمیزی β-cat (B').پس از سرکوب مسیر PI3K-AKT، سلول‌های کنترل دراز شدند (C) با گسترش β-cat (C')، در حالی که سلول‌های kd شروع به آپوپتوز (D) کردند، شبیه به جنین‌های بسیار جهش‌یافته ما و بتا گربه بسیار افزایش یافته را نشان دادند.رنگ آمیزی (D').پس از فعال‌سازی مسیر PI3K-AKT، سلول‌های کنترل مکعبی (E) باقی ماندند و دارای رنگ‌آمیزی طبیعی β-cat (E') بودند، در حالی که سلول‌های kd شکل سلولی (F) و رنگ‌آمیزی β-cat (F') را به طور قابل‌توجهی بهبود بخشیدند، که نشان می‌دهد (G) درجه تغییر شکل سلول در (AF) با استفاده از نسبت گردی سلول (CCR) طولانی‌ترین بعد (طول) و بعد عمودی مربوطه (عرض) با استفاده از نرم‌افزار MetaMorph اندازه‌گیری شد.سلول های SPECC1L-kd تیمار نشده (NT) (CCR = 3.46) به طور قابل توجهی طولانی تر از سلول های کنترل بودند (CCR = 1.56، p <6.1 × 10-13).مهار ورت از مسیر PI3K-AKT در سلول های کنترل برای ایجاد کشیدگی مشابه در شکل سلول کافی بود (CCR=3.61، p<2.4×10-9).به طور مشابه، فعال‌سازی AKT توسط SC-79 در سلول‌های SPECC1L-kd افزایش طول سلول را به سطوح کنترل بازگرداند (CCR = 1.74، p <6.2 × 10-12).تیمار ورتمانین سلول‌های SPECC1L-kd منجر به افزایش آپوپتوز شد اما افزایش بیشتری در تغییر شکل سلولی (CCR=3.60) در مقایسه با سلول‌های کنترل نشده تیمار نشده (CCR=3.46، ns) یا سلول‌های کنترل تیمار شده با ورتمانین (3.61) مشاهده شد.ns = مهم نیست.+/- اندازه گیری های SEM برای 50 سلول نشان داده شده است.تفاوت های آماری با استفاده از آزمون t-student محاسبه شد.
(الف) نمایش شماتیک مهار و فعال‌سازی مسیر PI3K-AKT که به ترتیب منجر به تغییرات AJ و نجات می‌شود.(B) مدل پیشنهادی برای تثبیت پروتئین AKT توسط SPECC1L.
CNCC های پیش از مهاجرت برای جدا شدن از سلول های عصبی اپیتلیال چین های عصبی قدامی نیاز به لیز AJ دارند1،15،32.افزایش رنگ‌آمیزی اجزای AJ و از بین رفتن توزیع نامتقارن AJ اپیکال-پایه در سلول‌های دارای کمبود SPECC1L، هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن، همراه با نزدیکی فیزیکی SPECC1L به β-کاتنین، نشان می‌دهد که SPECC1L برای حفظ پایداری موضعی AJ به درستی عمل می‌کند. عضلات سازماناسکلت سلولی اکتینارتباط SPECC1L با اسکلت سلولی اکتین و β-کاتنین و افزایش تعداد رشته های اکتین متراکم در غیاب SPECC1L با افزایش مشاهده شده در تراکم AJ مطابقت دارد.احتمال دیگر این است که افزایش تعداد فیبرهای اکتین در سلول های دارای کمبود SPECC1L منجر به تغییر در کشش بین سلولی شود.از آنجایی که تنش سلولی بر دینامیک AJ 33 تأثیر می گذارد، تغییرات ولتاژ می تواند منجر به انتشار بیشتر AJ 34 شود.بنابراین هر تغییری بر لایه‌های CNCC تأثیر می‌گذارد.
Wnt1 در چین‌های عصبی اولیه که باعث ایجاد سلول‌های تاج عصبی می‌شود، بیان می‌شود.بنابراین، ردیابی نسب Wnt1-cre هم NCC35 قبل و هم مهاجرت را نشان می‌دهد.با این حال، Wnt1 همچنین کلون‌های بافت مغز پشتی را نیز نشان می‌دهد که از چین‌های عصبی اولیه مشتق شده‌اند (35،36)، که این احتمال را ایجاد می‌کند که رنگ‌آمیزی ما از جهش‌های E9.5 برای نشانگرهای Wnt1 در چین‌های عصبی باز CNCC نیست.رنگ‌آمیزی مثبت ما برای نشانگرهای NCC AP2A و SOX10 تأیید کرد که چین‌های عصبی در معرض جنین‌های جهش یافته Specc11 واقعاً حاوی CNCC هستند.علاوه بر این، از آنجایی که AP2A و SOX10 نشانگرهای NCC مهاجرت اولیه هستند، رنگ‌آمیزی مثبت نشان داد که این سلول‌ها CNCC پس از مهاجرت هستند که نمی‌توانند توسط E9.5 طبقه‌بندی شوند.
داده های ما نشان می دهد که تنظیم مولکولی AJ توسط SPECC1L توسط سیگنالینگ PI3K-AKT واسطه می شود.سیگنال دهی AKT در سلول ها و بافت های دارای کمبود SPECC1L کاهش می یابد.یافته های Fantauzzo و همکاران.حمایت از نقش مستقیم سیگنالینگ PI3K-AKT در مورفوژنز جمجمه و صورت.(2014) نشان داد که عدم فعال سازی سیگنالینگ PI3K-AKT مبتنی بر PDGFRα منجر به یک فنوتیپ شکاف کام می شود.ما همچنین نشان می‌دهیم که مهار مسیر PI3K-AKT برای تغییر AJ و شکل سلول در سلول‌های U2OS کافی است.مطابق با یافته های ما، کاین و همکاران.37 نشان داد که کاهش زیر واحد PI3K α110 در سلول های اندوتلیال منجر به افزایش مشابهی در رنگ آمیزی بتا کاتنین اطراف سلولی می شود که به عنوان افزایش در "شاخص اتصال" نامیده می شود.با این حال، در سلول‌های اندوتلیال که رشته‌های اکتین آن‌ها از قبل بسیار سازمان‌دهی شده‌اند، سرکوب مسیر PI3K-AKT منجر به شل شدن شکل سلولی می‌شود.در مقابل، سلول‌های SPECC1L-kd U2OS یک شکل سلولی دراز را نشان دادند.این تفاوت ممکن است خاص نوع سلول باشد.در حالی که سرکوب سیگنالینگ PI3K-AKT به طور دائم اسکلت سلولی اکتین را تحت تأثیر قرار می دهد، تأثیر روی شکل سلول توسط تغییرات کشش ناشی از تغییر در تراکم و سازماندهی فیبرهای اکتین مرکزی تعیین می شود.در سلول‌های U2OS، ما فقط از تغییرات شکل سلولی به عنوان نشانگر تغییر و بازیابی AJ با کمبود SPECC1L استفاده کردیم.در نتیجه، ما فرض می کنیم که مهار مسیر AKT در کمبود SPECC1L، پایداری AJ را افزایش می دهد و لایه لایه شدن را در CNCC کاهش می دهد.
جالب توجه است، سطوح pan-AKT علاوه بر سطوح 473-AKT فسفریله در غیاب SPECC1L در شرایط in vitro و in vivo کاهش یافت که نشان‌دهنده تنظیم سیگنال‌دهی PI3K-AKT در سطح ثبات یا گردش پروتئین AKT است.ژن‌های SPECC1L و MID1 که هر دو با سندرم Opitz/GBBB مرتبط هستند، پروتئین‌هایی را کد می‌کنند که میکروتوبول‌ها را تثبیت می‌کنند.مکانیسمی که توسط آن SPECC1L و MID1 باعث تثبیت میکروتوبول می شود به طور کامل شناخته نشده است.در مورد SPECC1L، این تثبیت شامل استیلاسیون افزایش یافته زیرمجموعه ای از میکروتوبول ها 18 است.این امکان وجود دارد که SPECC1L از مکانیسم مشابهی برای تثبیت پروتئین های دیگر مانند AKT استفاده کند.نشان داده شده است که استیلاسیون بقایای لیزین در پروتئین AKT منجر به کاهش محلی سازی غشا و فسفوریلاسیون می شود.علاوه بر این، ubiquitination از زنجیره K63 در همان باقی مانده لیزین در AKT برای محلی سازی غشاء و فعال سازی آن مورد نیاز است39،40.در میان چندین فاکتور در تعامل با پروتئین‌های SPECC1L که در صفحات مختلف مخمر دو هیبریدی با کارایی بالا شناسایی شده‌اند، چهار مورد - CCDC841، ECM2942، APC و UBE2I43 - در چرخش یا پایداری پروتئین از طریق ubiquitination یا sumoylation نقش دارند.SPECC1L ممکن است در اصلاح پس از ترجمه بقایای لیزین AKT نقش داشته باشد و بر پایداری AKT تأثیر بگذارد.با این حال، نقش حیاتی SPECC1L در محلی سازی و پایداری پروتئین AKT هنوز مشخص نشده است.
نقص شدید در بیان SPECC1L در داخل بدن منجر به افزایش رنگ‌آمیزی نشانگر AJ و پوشش CNCC معیوب و همچنین افزایش آپوپتوز و مرگ‌ومیر اولیه جنینی شد.گزارش‌های قبلی نشان داده‌اند که موتان‌های موش با افزایش سطح آپوپتوز با نقایص لوله عصبی 44،45،46،47 و نقص‌های جمجمه و صورت48 مرتبط هستند.پیشنهاد شده است که مرگ بیش از حد سلولی در چین‌های عصبی یا قوس‌های حلقی ممکن است منجر به تعداد ناکافی سلول‌های مورد نیاز برای حرکت مورفوژنتیک مناسب شود (48،49،50).در مقابل، رده‌های سلولی کمبود SPECC1L ما با کاهش نسبتاً بیان SPECC1L تنها تغییرات AJ را بدون شواهدی از افزایش مرگ سلولی نشان دادند.با این حال، مهار شیمیایی مسیر PI3K-AKT در این سلول‌های Kd منجر به افزایش آپوپتوز شد.بنابراین، کاهش متوسط ​​در بیان یا عملکرد SPECC1L بقای سلول را تضمین می کند.این با مشاهداتی مطابقت دارد که جنین های جهش یافته Specc11 نادری که از دستگیری در خیابان می گریزند.E9.5 - شاید به دلیل کاهش بازده جذب ژن - می توانند لوله های عصبی خود را ببندند و در مراحل بعدی توسعه متوقف شوند، اغلب با نقایص جمجمه و صورت (شکل S3).همچنین با این امر مطابقت دارد، وقوع نادر جنین های هتروزیگوت Specc1l با ناهنجاری های جمجمه-صورتی - احتمالاً به دلیل افزایش کارایی جذب ژن - و همچنین یافته ای در گورخرماهی که در آن یکی از دو ارتولوگ SPECC1L (specc1lb) باعث از بین رفتن دیررس فنوتیپ های جنینی می شود. فک پایین و شکاف دوطرفه51.بنابراین، جهش های هتروزیگوت از دست دادن عملکرد SPECC1L شناسایی شده در بیماران انسانی ممکن است باعث اختلالات کوچک در عملکرد SPECC1L در طول مورفوژنز جمجمه-صورتی شود که برای توضیح شکاف دهانی آنها کافی است.تنظیم تماس های بین سلولی مبتنی بر SPECC1L نیز ممکن است در پالاتوژنز و همجوشی قوس های حلقی نقش داشته باشد.مطالعات بیشتر در مورد عملکرد SPECC1L به روشن شدن نقش تماس های موقت بین سلولی در CNCC در طول بسته شدن لوله عصبی در تحرک سلول های عصبی اپیتلیال و مورفوژنز جمجمه-صورتی کمک می کند.
کنترل استئوسارکوم U2OS و سلول های SPECC1L-kd قبلاً توضیح داده شده است (سعدی و همکاران، 2011).آنتی بادی ها علیه SPECC1L نیز قبلاً مشخص شده اند (سعدی و همکاران، 2011).آنتی بادی های ضد β-کاتنین (خرگوش؛ 1:1000؛ سانتا کروز، دالاس، TX) (موش؛ 1:1000؛ فناوری سیگنالینگ سلولی، Danvers، MA)، میوزین IIb (1:1000؛ سیگما-آلدریش، سنت لوئیس) ) ، MO) ، E-cadherin (1:1000؛ Abkam، کمبریج، MA)، AP2A (1:1000؛ Novus Biologicals، Littleton، Colo.)، SOX10 (1:1000؛ 1000؛ Aviva Systems Biology، San Diego ، کالیفرنیا)، DLX2 (1:1000؛ Abcam، کمبریج، MA)، phospho-Ser473-AKT (1:1000؛ Cell Signaling Technology، Danvers، MA)، pan-AKT (1:1000؛ ThermoFisher Scientific، Waltham، MA ) ، KI67 (1:1000؛ Cell Signaling Technology، Danvers، MA)، کاسپاز بریده شده 3 (1:1000؛ Cell Signaling Technology، Danvers، MA) و β-اکتین (1:2500؛ Sigma-Aldrich، سنت لوئیس، MO ) همانطور که توضیح داده شد استفاده شد..رشته های اکتین با فالوئیدین رودامین اکتی رنگ آمیزی شدند (سیتواسکلتون، دنور، کلرادو).
سلول‌های کنترل U2OS و سلول‌های SPECC1L-kd در DMEM استاندارد با گلوکز بالا که با 10 درصد سرم جنین گاو تکمیل شده بود (Life Technologies، Carlsbad، CA) کشت داده شدند.برای تغییرات AJ، 2 × 105 سلول بر روی شیشه تیمار شده با ژلاتین خوک 0.1٪ (سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، MO) کاشته شد و برای تغییرات در شکل سلول مشاهده شد.سلول ها در مقاطع زمانی مشخص شده مختلف جمع آوری شدند: 4 ساعت پس از کاشت (t = 1)، 24 ساعت پس از کاشت (t = 2)، تلاقی بدون تغییر در شکل سلول (t = 3)، تغییر در شکل سلول (t = 4) ، 24 ساعت پس از تغییر شکل سلول (t = 5) و 48 ساعت پس از تغییر شکل سلول (t = 6) (شکل 1، 2، 3).برای تعدیل مسیر PI3K-AKT، سلول‌ها در غلظت‌های مشخص شده با ورتماننین بازدارنده PI3K-AKT (TOCRIS Biosciences، Minneapolis، Minnesota) یا فعال‌کننده SC-79 (TOCRIS Biosciences، Minneapolis Adams، Minnesota) کشت شدند.محیط حاوی مواد شیمیایی روزانه تغییر می کرد.
ضبط فریم به فریم روی کنترل زنده و سلول‌های KD در شرایط کشت نرمال انجام شد و تصاویر کنتراست فاز هر 10 دقیقه به مدت 7 روز جمع‌آوری شد.تصاویر با استفاده از یک میکروسکوپ معکوس Leica DM IRB با کنترل کامپیوتری مجهز به یک مرحله مکانیکی و یک هدف N-PLAN 10 × متصل به یک دوربین QImaging Retiga-SRV به دست آمد.در طول تصویربرداری، کشت سلولی در دمای 37 درجه سانتیگراد در یک اتمسفر مرطوب با 5٪ CO2 نگهداری شد.
دو رده سلولی تله ژنی ES DTM096 و RRH048 از مرکز منابع موش جهش یافته منطقه ای (UC Davis، CA) برای تولید خطوط موش با کمبود Specc11 با نام های Specc1lgtDTM096 و Specc1lgtRRH046 استفاده شد.به طور خلاصه، سلول های 129/REJ ES به بلاستوسیست های C57BL6 تزریق شد.موش های نر کایمریک حاصل با موش های ماده C57BL6 برای شناسایی فرزندان با رنگ پوشش آگوتی پرورش داده شدند.برای شناسایی هتروزیگوت ها از حضور درج های ناقل تله ژنی استفاده شد.موش ها روی یک پس زمینه مخلوط 129/REJ؛ C57BL6 نگهداری شدند.محل درج ناقل تله ژنتیکی توسط RT-PCR، توالی یابی ژنوم و تکمیل ژنتیکی تایید شد (شکل تکمیلی 1).برای ردیابی اصل و نسب CNCC موش‌های هتروزیگوت دوگانه Specc1lGT، موش‌های ROSAmTmG (#007576) و Wnt1-Cre (#003829) (آزمایشگاه جکسون، بار هاربر، ME) برای تولید ROSAMTmG و WntTmG و Wnt1-inccs all.تمام آزمایش‌ها بر روی موش‌ها طبق پروتکل‌های تأیید شده توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات در مرکز پزشکی دانشگاه کانزاس انجام شد.
جنین ها در (1% فرمالدئید، 0.2% گلوتارآلدئید، 2 میلی مولار MgCl2، 0.02% NP-40، 5 میلی مولار EGTA) به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق ثابت شدند.پس از تثبیت در محلول رنگ‌آمیزی X-gal (5 میلی‌مولار فریسیانید پتاسیم، 5 میلی‌مولار فروسیانید پتاسیم، 2 میلی‌مولار MgCl2، 0.01 درصد سدیم دئوکسی کولات، 0.02 درصد NP-40، 1 میلی‌مولار بر میلی‌لیتر X-gal) ایجاد رنگ در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. .درجه سانتیگراد در عرض 1-6 ساعت.جنین ها پس از تثبیت در 4٪ PFA و مشاهده شدند.
برای وسترن بلات، سلول ها در بافر لیز غیرفعال (Promega، Fitchburg، WI) همراه با مخلوطی از مهارکننده های پروتئاز HALT (سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO) لیز شدند.لیزات ها بر روی ژل های آماده Mini-PROTEAN TGX 12% پلی آکریل آمید (Bio-Rad, Hercules, CA) پردازش و به غشاهای Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA) منتقل شدند.غشاها در شیر 5 درصد در PBS حاوی 0.1 درصد توئین مسدود شدند.آنتی بادی ها یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد یا به مدت یک ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند.معرف Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) برای تولید سیگنال استفاده شد.برای رنگ آمیزی ایمنی، جنین ها یک شبه در 4% PFA/PBS تثبیت شدند و انجماد شدند.انجماد بافت در PBS حاوی 1٪ سرم طبیعی بز (Thermo Scientific, Waltham, MA) و 0.1٪ Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) مسدود شد و سپس در 4 درجه سانتیگراد در انکوباتور در طول دوره انکوبه شد. شببا آنتی بادی و آنتی بادی ثانویه فلورسنت (1:1000) به مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد.مقاطع رنگ‌آمیزی شده در محیط طلای ProLong (Thermo Scientific، Waltham MA) قرار گرفتند و تصاویر مسطح با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال Leica TCS SPE تهیه شد.هر رنگ‌آمیزی ایمنی به‌عنوان سه آزمایش مستقل بر روی برش‌های حداقل دو جنین جهش یافته انجام شد.یک ازمایش نمونه نشان داده شده است.
سلول ها در بافر RIPA اصلاح شده (20 میلی مولار Tris-HCl، pH 8.0، 1٪ NP-40، 130 میلی مولار NaCl، 10٪ گلیسرول، 2 میلی مولار EDTA، و مهارکننده پروتئاز HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) انکوبه شدند. به طور خلاصه، لیزها با دانه‌های مغناطیسی پروتئین G (Life Technologies، Carlsbad، CA) از پیش خالص‌سازی شدند و سپس به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. با دانه‌های پروتئین پروتئین G anti-SPECC1L یا IgG برای استخراج SPECC1L استفاده شد و وسترن بلات با استفاده از ضد انجام شد. آنتی بادی -β-کاتنین که در بالا توضیح داده شد آزمایش های co-IP نشان داده شده نماینده چهار آزمایش مستقل هستند.
سلول های کشت شده ثابت یا بافت های جنینی موش به مرکز میکروسکوپ الکترونی در مرکز پزشکی دانشگاه کانزاس ارائه شد.به طور خلاصه، نمونه‌ها در رزین EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences، Fort Washington, PA)، یک شبه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد پلیمریزه شدند و با استفاده از اولترامیکروتوم Leica UC7 مجهز به یک تیغه الماس، در 80 نانومتر برش داده شدند.مقاطع با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری JEOL JEM-1400 مجهز به تفنگ 100 کیلوولت Lab6 مشاهده شدند.
نحوه استناد به این مقاله: Wilson, NR et al.کمبود SPECC1L منجر به افزایش پایداری مفاصل متصل شده و کاهش لایه لایه شدن سلول های تاج عصبی جمجمه می شود.علم.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
سن ژان، جی.القا و تمایز تاج عصبی.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com، 2006).
کوردرو، DR و همکاران.سلول های تاج عصبی جمجمه در حرکت: نقش آنها در رشد جمجمه-صورتیمجله آمریکایی ژنتیک پزشکی.قسمت A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland، RP Neurocristopathia: رشد و توسعه آن طی 20 سال.متخصص اطفال.آسيب شناسي.آزمایشگاه.دارو.17، 1-25 (1997).
Mangold E.، Ludwig KU و Noten MM پیشرفت در ژنتیک شکاف های دهانی صورت.روندها در پزشکی مولکولی 17، 725-733، doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. and Riley, FM مکانیسم‌های مولکولی مهاجرت سلول‌های تاج عصبی جمجمه و الگوبرداری در طول رشد جمجمه و صورت.توسعه 137، 2605-2621، doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon، MJ، Marazita، ML، Beaty، TH و Murray، JK شکاف لب و کام: درک تأثیرات ژنتیکی و محیطی.نظر طبیعیژنتیک 12، 167-178، doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
اینگرام، CR و همکاران.مورفوژنز غیرطبیعی پوست، اندام ها و ناحیه جمجمه صورت در موش های دارای کمبود فاکتور 6 (Irf6) تنظیم کننده اینترفرون.ژنت ملی38، 1335-1340، doi: 10.1038/ng1903 (2006).
پیرارد-جانوید، ام و همکاران.جهش های غالب در GRHL3 باعث ایجاد سندرم واندر واورد و اختلال در رشد پریدرم دهان می شود.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
هریس، ام جی و جوریلوف، DM لیست جهش یافته های موش با نقص در بسته شدن لوله عصبی را به روز کنید و به سمت درک ژنتیکی کامل بسته شدن لوله عصبی پیشرفت کنید.بررسی نقایص مادرزادی.قسمت A، تراتولوژی بالینی و مولکولی 88، 653-669، doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo، KA و Soriano، P. سیگنالینگ PDGFRalpha با واسطه PI3K، بقا و تکثیر در رشد اسکلتی را از طریق یک مسیر درون سلولی وابسته به p53 تنظیم می کند.توسعه ژن 28، 1005-1017، doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp، AJ، Green، ND و Murdoch، JN Disheveled: رابطه انبساط همگرا با بسته شدن لوله عصبی.گرایش های عصب شناسی26، 453–455، doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).