347 جزء شیمیایی لوله‌های مارپیچ فولادی ضد زنگ، شناسایی پروتئین‌های چاپرون آنتی‌ژن لکوسیت انسانی جدید پاسخ‌دهنده به اینترفرون (HLA-A) با استفاده از طیف‌سنجی جرمی متقاطع (CLMS)

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.شما از یک نسخه مرورگر با پشتیبانی محدود CSS استفاده می کنید.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نشان می‌دهیم.
اسلایدرهایی که سه مقاله را در هر اسلاید نشان می دهند.برای حرکت در اسلایدها از دکمه های پشت و بعدی استفاده کنید یا از دکمه های کنترلر اسلاید در انتها برای حرکت در هر اسلاید استفاده کنید.

توضیحات محصول

لوله های کویل فولادی ضد زنگ 347L، درجه فولاد: SS347L

سیستم سیگنال دهی اینترفرون یک پاسخ سیتوکین قوی را به طیف وسیعی از سیگنال های پاتولوژیک بیماری زا و ذاتی از محیط القا می کند و در نتیجه باعث القای زیر مجموعه هایی از پروتئین های القایی با اینترفرون می شود.ما از طیف‌سنجی جرمی پیوند متقاطع (CLMS) با واسطه DSS برای تشخیص برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین جدید در حوزه پروتئین‌های ناشی از اینترفرون استفاده کردیم.علاوه بر پروتئین‌های قابل القاء با اینترفرون مورد انتظار، ما همچنین ترکیب‌های اضافی پیوند متقابل بین مولکولی و درون مولکولی جدیدی از پروتئین‌های متعارف القایی با اینترفرون مانند MX1، USP18، OAS3، و STAT1 را شناسایی کردیم.ما روی اعتبار سنجی متعامد مجموعه جدیدی از شبکه‌های پروتئینی القایی با اینترفرون که توسط پروتئین‌های HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) با استفاده از رسوب ایمنی مشترک و مطالعه بیشتر آنها با استفاده از مدل‌سازی دینامیک مولکولی تشکیل شده‌اند، تمرکز کردیم.مدل‌سازی پویایی ساختاری مجتمع پروتئین چندین مکان تعامل را نشان داد که برهمکنش‌های شناسایی‌شده در یافته‌های CLMS را منعکس می‌کردند.با هم، ما یک مطالعه آزمایشی از CLMS برای شناسایی کمپلکس‌های سیگنالینگ جدید القا شده توسط اینترفرون ارائه می‌کنیم و مشتاقانه منتظر استفاده گسترده‌تر از CLMS برای شناسایی پویایی‌های جدید تعاملات پروتئین در ریزمحیط تومور هستیم.
قبل از شروع پاسخ ایمنی تطبیقی، سیستم دفاعی ذاتی میزبان یک پاسخ ضد میکروبی را با واسطه خانواده ای از سیتوکین های آلفا-مارپیچ ترشح شده به نام اینترفرون (IFN) ایجاد می کند.کلاس های IFN نوع I IFNα و IFNβ پاسخ های سلولی، از جمله حالت های ضد ویروسی، پرواپوپتوز، پیش التهابی و ضد تکثیر را فعال می کنند.در انسان، 13 زیرگروه IFNα شناخته شده است، که همگی روی کروموزوم 91 قرار گرفته اند. با کمال تعجب، تنها IFNα2 برای استفاده بالینی مورد مطالعه قرار گرفته است.اخیراً توجه ویژه ای به تحقیقات در مورد سایر زیرگروه های IFNα شده است.یک مطالعه اخیر نشان داد که IFNα14 یکی از مؤثرترین ایزوفرم ها در محدود کردن تکثیر HBV2 و HIV-13،4 در مقایسه با زیرگروه IFNα2 متعارف است.
مشخص شده است که کمپلکس‌های گیرنده اینترفرون نوع I فعال شده (IFNAR1 و IFNAR2) باعث ایجاد یک آبشار انتقال سیگنال به واسطه Janus kinases TYK2 و JAK15,6 می‌شوند.این جانوس کینازها مبدل‌های سیگنال و فعال‌کننده‌های پروتئین رونویسی (STAT1 و STAT2) را روی باقی‌مانده‌های تیروزین فسفریله می‌کنند تا هترودایمریزاسیون با واسطه دامنه SH2 را آغاز کنند.متعاقبا، IRF9 هترودایمرهای STAT را به یک کمپلکس تریمریک از ژن فاکتور 3 تحریک شده با IFN (ISGF3) متصل می کند، که به هسته منتقل می شود و باعث رونویسی بیش از 2000 ژن تحریک شده با اینترفرون (ISGs) 5،6،7،8 می شود.
ISG ها ستون فقرات سیستم ایمنی ذاتی را تشکیل می دهند، به ویژه در پاسخ به حمله ویروسی.به عنوان اولین خط دفاعی در برابر عفونت ویروسی، سلول ها به سرعت فعل و انفعالات گسترده ای از پروتئین های سلولی را با طیف وسیعی از فعالیت های بیولوژیکی به کار می گیرند.این پروتئین‌ها شامل گیرنده‌های تشخیص الگو، مولکول‌های سیگنال‌دهنده، فاکتورهای رونویسی و پروتئین‌هایی با عملکرد مستقیم ضد ویروسی و همچنین تنظیم‌کننده‌های منفی پاسخ‌های ایمنی هستند.بسیاری از اطلاعات در مورد فعالیت ISG از صفحه نمایش های عملکردی با استفاده از صفحه نمایش های بیان بیش از حد 10،11 یا تکنیک های خاموش کردن ژن (siRNA، RNAi و CRISPR) 12،13 می آید که در آن ISG های فردی بیان یا مهار می شوند و فعالیت آنها بر روی ویروس های مختلف آزمایش می شود.اگرچه این مطالعات خواص ضد ویروسی تک تک ISG ها را مشخص کرده اند، مکانیسم های مولکولی زیربنایی هر ISG تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده است.به طور کلی پذیرفته شده است که بسیاری از پروتئین ها برای اطمینان از فعالیت کامل با یک یا چند سیتوکین برهمکنش می کنند، بنابراین یا ISG ها به طور مستقیم برهم کنش دارند یا برهمکنش آنها توسط پروتئین های سلولی واسطه می شود.به عنوان مثال، یک مطالعه اخیر پروتئومیکس متقاطع نوری، ATPase VCP/p97 را به عنوان شریک اصلی تعامل IFITM3 شناسایی کرد که مهار آن منجر به نقص در مرتب‌سازی لیزوزومی، گردش و انتقال همزمان IFITM3 با ذرات ویروسی می‌شود.با استفاده از رسوب ایمنی، ما VAPA، یک پروتئین مرتبط با وزیکول را به عنوان شریک تعاملی با IFITM1/2/3 که واسطه بلوغ ویروسی با واسطه کلسترول است، شناسایی کردیم، و این توسط مطالعه دیگری با استفاده از یک سیستم دو هیبریدی مخمر تایید شد.پشتیبانی علمی 15 , 16 .
یک فرآیند بیولوژیکی اساسی که در سرکوب عفونت و تبدیل بدخیم دخیل است، ارائه آنتی ژن است که توسط مولکول های اصلی کمپلکس سازگاری بافتی (MHC) واسطه می شود.پپتیدها (طول 8-12 اسید آمینه) از پروتئین های شکافته شده، زودتر از موعد خاتمه یافته یا به اشتباه تا شده در هترودایمر MHC-I (شامل زنجیره های سنگین و سبک MHC-I، به نام β-2-میکروگلوبولین؛ β2M) بارگذاری می شوند 17،18.تریمرهای پایدار MHC-I حاصل به سطح سلول منتقل می‌شوند، جایی که پپتیدهای داخل سلولی را به سلول‌های CD8+ T (سلول‌های T سیتوتوکسیک) ارائه می‌کنند.سلول های T این پاتوژن ها و سلول های حامل آنتی ژن اختصاصی تومور را شناسایی و از بین می برند.در نتیجه، پاتوژن ها و سلول های تومور اغلب فرآیند ارائه آنتی ژن را سرکوب می کنند تا از نظارت ایمنی جلوگیری کنند.علاوه بر این، MHC-I در 90-40 درصد تومورهای انسانی کاهش می یابد و اغلب با پیش آگهی ضعیف تری همراه است.
ژن های دخیل در پاسخ به پاتوژن ها باید به سرعت بین حالت استراحت و رونویسی فعال جابجا شوند.بنابراین، فرض بر این است که چندین پروتئین سلولی در پاسخ به تقاضای بالای IFN در دوره‌های زمانی کوتاه، از جمله بازسازی و اصلاح کروماتین پروموتر دخیل هستند.اکثر مطالعات بر شناسایی شرکای پروتئین ISG در حضور IFN متمرکز شده اند.چندین مطالعه پروتئومی و ترانسکریپتومی در سیستم های سلولی مدل، اثر IFN را بر چشم انداز سلولی روشن کرده است.با این حال، علیرغم درک رو به رشد پویایی ناشی از اینترفرون ها، ما هنوز اطلاعات کمی در مورد دخالت ISG ها داریم.وقتی پیچیدگی و دینامیک وابسته به زمان سیگنال دهی اینترفرون را در نظر می گیریم، دو سوال مطرح می شود: (1) آیا می توان کمپلکس های چند پروتئینی را که در سیگنال دهی سریع نقش دارند، تثبیت کرد و به دام انداخت، و (2) آیا می توان این تعاملات را در فضای سه بعدی ترسیم کرد؟
برای پرداختن به این مسائل، ما پیوند متقابل شیمیایی (DSS) با واسطه دی‌سوکسینیمید را به همراه طیف‌سنجی جرمی (CLMS) برای مطالعه شبکه برهمکنش پروتئین ناشی از IFNα و پویایی آن اجرا کردیم.DSS پیوندهای کووالانسی را بین باقی مانده های پروگزیمال پروتئین ها و/یا کمپلکس های پروتئینی در داخل بدن اضافه می کند.تجزیه و تحلیل بعدی MS، محل‌های پیوند متقابل خاصی را نشان می‌دهد که نشان‌دهنده نزدیکی فضایی مناطق درون یک پروتئین خاص، به نام پیوندهای داخلی، یا زیر واحدها در مجتمع‌های پروتئینی، به نام روابط متقابل است.با استفاده از این رویکرد، ما چندین کمپلکس جدید پروتئین-پروتئین و همچنین شبکه‌های تعامل چند پروتئینی ناشی از اینترفرون را شناسایی کرده‌ایم.با آزمایش بیشتر زیرمجموعه‌ای از این تعاملات جدید، نشان می‌دهیم که H2BFS (FS نوع هیستون H2B؛ که از این پس H2B نامیده می‌شود) و MDN1 به‌عنوان شرکای اتصال برای HLA-A عمل می‌کنند.
سلول‌های Flo-1 یکی از شناخته‌شده‌ترین مدل‌های آزمایشگاهی آدنوکارسینوم مری هستند زیرا ویژگی‌های کلیدی تومورهای مری را تقلید می‌کنند.با این حال، همه تومورها ایمنی زا نیستند و برای تعیین اینکه آیا سلول های Flo-1 به درمان با اینترفرون پاسخ می دهند، سلول های Flo-1 را با 10 نانوگرم در میلی لیتر IFNα به مدت 72 ساعت درمان کردیم.سلول های Flo-1 القای اولیه pSTAT1 و IRF1 را نشان دادند که 2 ساعت پس از درمان شروع شد و تا 72 ساعت ادامه یافت، با کاهش وابسته به زمان در سطوح ثابت IRF1 (شکل 1A).مشخص شد که ISGها (MX1، IFITM1، OAS1/2، و ISG15) پس از 6 ساعت به شدت القا می‌شوند و پاسخ‌های کلاسیک فاز میانی و اواخر به IFNα را تقلید می‌کنند (شکل 1A).این داده ها با هم نشان می دهد که این مدل سلولی می تواند برای مطالعه پاسخ های اینترفرون استفاده شود.
پاسخ های بیان پروتئین متفاوت در سلول های Flo-1 پس از درمان IFNα.(الف) بیان پروتئین در سلول‌های Flo-1 تیمار شده با 10 نانوگرم در میلی‌لیتر IFNα به مدت 2، 6، 24، 48 و 72 ساعت توسط ایمونوبلات با استفاده از آنتی‌بادی‌های ISG نشان‌داده‌شده آنالیز شد.(ب) ژل‌های SDS-PAGE رنگ‌آمیزی Coomassie blue از عصاره‌های سلول کامل پس از اتصال عرضی با DSS برای زمان‌ها و غلظت‌های مشخص شده.(C) ایمونوبلات نماینده با آنتی بادی p53 (DO-1) از همان نمونه ها برای ارزیابی درجه اتصال متقابل پروتئین مورد بررسی قرار گرفت.
برای به تصویر کشیدن چشم انداز برهم کنش پروتئین در محل، ما از DSS، یک عامل پیوند متقابل پرکاربرد به دلیل نفوذپذیری بالای غشاء و زمان واکنش نسبتاً کوتاه آن استفاده کردیم.زمان واکنش کوتاه‌تر به جلوگیری از تشکیل توده‌های بزرگ پروتئین‌های دارای پیوند عرضی کمک می‌کند و در نتیجه پایداری اتصال دهنده را حفظ می‌کند.برای تعیین غلظت بهینه DSS و جلوگیری از اتصال بیش از حد متقاطع، ابتدا سلول‌ها را به ترتیب به مدت 5، 10، 5 و 30 دقیقه در معرض 5، 2.5 و 1 میلی‌مولار DSS قرار دادیم و لیزها را با SDS-PAGE رنگ‌آمیزی Coomassie تجزیه و تحلیل کردیم. (داده ها نشان داده نشده است).به نظر می رسد که لیزات سلولی در کمترین غلظت و در کوتاه ترین زمان به شدت دارای پیوند متقابل هستند.بنابراین، DSS طی 5 دقیقه به 1، 0.5 و 0.1 میلی مولار تیتر شد (شکل 1B).اتصال عرضی بهینه با 0.5 میلی مولار DSS به مدت 5 دقیقه مشاهده شد و این شرایط برای سلول های تیمار شده با IFNα انتخاب شد.علاوه بر این، شکل 1C یک وسترن بلات را نشان می دهد که با استفاده از آنتی بادی p53 (DO-1) برای ارزیابی درجه اتصال متقابل پروتئین انجام شده است.
سلول های Flo-1 با 10 نانوگرم در میلی لیتر IFNα به مدت 24 ساعت قبل از افزودن کراسلینکر تیمار شدند.سلول های متقاطع متعاقبا با پروتئولیز دو مرحله ای لیز شدند و پروتئین ها توسط FASP پردازش شدند (شکل 2) 24،25.پپتیدهای تریپتیک متقاطع با طیف سنجی جرمی آنالیز شدند (شکل 2).سپس طیف MS/MS با توالی پروتئین مطابقت داده می شود و با MaxQuant26،27 اندازه گیری می شود.پپتیدهای متقابل از طیف های به دست آمده با استفاده از برنامه SIM-XL شناسایی شدند و ترکیبات فردی با استفاده از خطوط لوله نرم افزار محاسباتی منبع باز xQuest28 و SIM-XL29 در یک شبکه پیچیده ترکیب شدند (شکل 2).SIM-XL فعل و انفعالات پروتئین- پروتئین، زنجیره های داخلی و زنجیره های فردی را در مخلوط های پروتئینی ساده یا پیچیده شناسایی می کند و اسکریپت هایی را برای تجسم تعاملات در ساختارهای پروتئینی ارائه می دهد.علاوه بر این، هر ارجاع متقابل را به عنوان یک امتیاز ID با توجه به کیفیت طیف MS/MS29 رتبه بندی می کند.چندین برهمکنش و کمپلکس پروتئین-پروتئین بسیار قابل اعتماد شناسایی شده‌اند، و مجموعه جدیدی از برهمکنش‌ها با استفاده از رسوب همزمان و تغییرات ساختاری کمپلکس‌ها با استفاده از مدل‌سازی دینامیک مولکولی (MD) بیشتر مورد بررسی قرار گرفته‌اند (شکل 2) 30، 31.
نمای کلی شماتیک روش CLMS.سلول‌های Flo-1 با 10 نانوگرم در میلی‌لیتر IFNα به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و سپس پیوند متقابل پروتئین در محل با استفاده از DSS و سپس لیز سلولی و تریپسینیزاسیون انجام شد.نمونه های متقاطع با استفاده از طیف سنج جرمی Orbitrap مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و بیشتر برای قطعه قطعه شدن پیش سازهای پپتیدی در طول LC-MS/MS نمونه برداری شدند.دو پپتید متصل از طیف‌های به‌دست‌آمده با استفاده از دستگاه تشخیص طیف از برنامه پپتیدهای متقاطع (SIM-XL) شناسایی شدند و همه ترکیبات با استفاده از خطوط لوله محاسباتی در یک شبکه پیچیده ترکیب شدند.فعل و انفعالات با اطمینان پایین را بر اساس امتیازات نرخ مثبت کاذب (FDR) فیلتر کنید.چندین تعامل جدید پروتئین-پروتئین با وفاداری بالا با استفاده از رسوب همزمان ایمنی تأیید شد و تغییرات ساختاری در مجتمع‌ها با استفاده از مدل‌سازی دینامیک مولکولی (MD) مورد بررسی قرار گرفت.
در مجموع 30500 و 28500 پپتید با استفاده از MaxQuant به ترتیب در نمونه های IFNα تحریک نشده و تحریک شده شناسایی شد (جدول تکمیلی S1، شکل 3A).توزیع طول پپتید در هر دو مورد، نسبت بیشتری از پپتیدهای بزرگتر را نشان داد، که نشان دهنده وجود پپتیدهای متقاطع است (شکل 3B،C).علاوه بر این، نسبت بیشتری از پپتیدهای بزرگتر در محدوده 40-55 در نمونه های تیمار شده با IFNα وجود داشت (شکل 3C).نقشه برداری پروتئین در برابر شدت log2 نشان داد که پروتئین های کلاسیک تحریک شده با اینترفرون در مقایسه با نمونه های تیمار نشده، از جمله MX1، IFIT1/3، OAS2/3، DDX58، و HLA-F فراوان ترین هستند (شکل 3D).تجزیه و تحلیل مسیرهای پروتئین‌هایی که بیش از سه برابر در پاسخ به درمان IFNα با استفاده از پایگاه داده مسیر Reactome غنی ​​شده‌اند، نشان داد که ارائه و پردازش آنتی‌ژن با واسطه MHC-I غالب‌ترین مسیر بود (شکل 3E).مطابق با گزارش‌های قبلی، پاسخ‌های ضد ویروسی با واسطه OAS و ISG15 و همچنین سیگنال‌دهی IFNα/β و سیتوکین از جمله مسیرهای فعال‌شده بودند.علاوه بر این، پیوندهای متقابل پروتئین اختصاصی لیزین و سرین از طیف‌های MS/MS در ابتدا با استفاده از SIM-XL شناسایی شدند.یک مطالعه اخیر 104 ISG را گزارش کرد که شامل 20 ویروس از 9 کلاس ویروسی با متاآنالیز مطالعات بیان بیش از حد ISG در 5 نوع سلول بود.با این حال، برای غلبه بر محدودیت‌های محاسباتی غربالگری مجموعه‌های داده بزرگ، ما با مجموعه داده‌های کوچک‌تری شروع کردیم تا تعاملات احتمالی بین فهرست ژن‌های IRDS گزارش‌شده توسط Padaria و همکاران را بررسی کنیم، که بیشتر آنها ISG هستند.
شناسایی پروتئین های متقابل بیان شده متفاوت در پاسخ به IFNα (داده های بدست آمده از MaxQuant).(الف) نمودار ون نشان دهنده تعداد پپتیدهای رایج و انحصاری شناسایی شده در نمونه های Flo-1 تیمار شده و تیمار نشده با IFNα14 است.توزیع طول پپتید نمونه‌های دارای پیوند متقابل تیمار نشده (B) و تیمار شده با IFNα (C).(د) نقشه حرارتی نشان دهنده log2 (شدت LFQ) بین سلول های Flo-1 تیمار نشده و تیمار نشده با IFNα14.پانل سمت چپ پروتئین‌هایی را نشان می‌دهد که در حضور IFNα فعال‌تر هستند.(E) هیستوگرام نشان دهنده 20 مسیر اصلی غنی سازی پس از درمان IFNα.پایگاه داده مسیر Reactome بیش از چهار برابر تغییرات در پروتئین‌های پاسخگو به IFNα تنظیم شده را تجزیه و تحلیل کرد.
تحریک ISG با واسطه اینترفرون به خوبی مستند شده است، اما در سطح مولکولی به خوبی درک نشده است که چگونه این پروتئین ها در طیف گسترده ای از عملکردهای بیولوژیکی به اوج می رسند.ما تعاملات پروتئین را با درجه بالایی از اطمینان بین ISGهای شناخته شده بررسی کردیم.جالب توجه است، ما شبکه‌ای شامل پروتئین‌های MX1، USP18، ROBO1، OAS3، و STAT1 را شناسایی کردیم که یک مجتمع بزرگ را در پاسخ به درمان IFNα تشکیل می‌دهند (شکل 4، جدول S2) 32،33،34.مهمتر از همه، این فعل و انفعالات در تمام سه تکرار تحت درمان با IFNα یافت شد و در نمونه های تیمار نشده یافت نشد، که نشان می دهد آنها به طور خاص در پاسخ به درمان IFNα تشکیل شده اند.مشخص است که STAT1 به صورت رونویسی بیان این ISG ها را تنظیم می کند، اما تعامل آن با ISG ها در سطح پروتئین مورد مطالعه قرار نگرفته است.ساختار کریستالی STAT1 نشان داد که دامنه مارپیچی آن (CCD) در برهمکنش با DNA یا پروتومرها در طول تشکیل دایمرها دخالتی ندارد.این مارپیچ‌های α یک ساختار مارپیچ مارپیچ را تشکیل می‌دهند که سطحی عمدتاً آبدوست را برای وقوع فعل و انفعالات فراهم می‌کند.در داده‌های CLMS ما مشاهده کردیم که بیشتر برهمکنش‌ها با STAT1 در حوزه SH2 قبل از CCD، دامنه پیوند دهنده یا دم C ترمینال (باقی‌مانده‌های 700-708) رخ داده است (شکل 4A).یک مطالعه قبلی گزارش داد که USP18 به CCD و دامنه اتصال به DNA (DBD) STAT2 متصل می‌شود و به زیرواحد گیرنده اینترفرون نوع I IFNAR2 برای مهار سیگنال‌دهی اینترفرون نوع I وارد می‌شود.داده‌های ما همچنین نشان داد که دامنه کاتالیزوری USP18 با STAT1 DBD تعامل دارد (شکل 4A,D)، که نشان می‌دهد هر دو STAT1 و STAT2 ممکن است در جذب USP18 به IFNAR2 نقش داشته باشند.
شبکه ISG پروتئین-پروتئین در سلول های پیوند متقابل تیمار شده با IFNα شناسایی شد.(الف) نمودار برهمکنش دوبعدی که برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین را نشان می‌دهد (تولید شده در برنامه SIM-XL)، با خطوطی که برهمکنش‌های بین مولکولی را نشان می‌دهند (قطع اتصال متقاطع روی 3.5 تنظیم شده است).دامنه‌های هویت‌های مختلف با رنگ 32 مشخص می‌شوند: دامنه MX1، Dynamin_N (73-249)، Dynamin_M (259-547)، و GED (569-660).دامنه های OAS3: OAS1_C (160-344)، OAS1_C (559-745)، NTP_transf_2 (780-872)، و OAS1_C (903-108).دامنه ROBO1، Ig_3 (67–151)، I-set (170–258)، I-set (262–347)، Ig_3 (350–432)، Ig_3 (454–529)، fn3 (562–646)، fn3 (678-758) و fn3 (777-864).فیلدهای STAT1: STAT_int (2-120)، STAT_alpha (143-309)، STAT_bind (321-458)، SH2 (573-657)، و STAT1_TAZ2bind (715-739).(ب) نمایشگر دایره‌ای پروتئین‌های دارای پیوند متقابل (MX1، UBP18، OAS3، ROBO1، و STAT1) با برهم‌کنش‌ها و برهمکنش‌هایی که به ترتیب به رنگ‌های آبی و قرمز برچسب‌گذاری شده‌اند.آستانه پیوند متقابل 3.5 تعیین شد.نمودارهای نقطه‌ای نشان‌دهنده مکان‌های تعامل STAT1 با MX1 (C)، USP18 (D)، ROBO1 (E) و OAS3 (F)، و همچنین مکان‌های تعامل K یا S بین دو پپتید است.در شکل، آستانه امتیاز پیوند متقابل 3.0 تعیین شده است.(ز) مکان‌های تعامل مختلف بین دامنه‌های STAT1 و OAS3 DI که بر روی ساختارهای پروتئینی آنها در PyMol قرار گرفته‌اند (سیستم گرافیک مولکولی PyMOL، نسخه 2.0 شرودینگر، LLC).STAT1 (idb id: 1bf533) و OAS3 (pdb id: 4s3n34).) برنامه.
دو ایزوفرم USP18 در انسان توصیف شده است، یک پروتئین تمام قد که عمدتاً در هسته قرار دارد، و یک ایزوفرم بدون دامنه N ترمینال، USP18-sf، که به طور مساوی در سیتوپلاسم و هسته توزیع شده است.علاوه بر این، انتهای N پیش‌بینی شد که ساختاری ندارد و نیازی به فعالیت ایزوپپتیداز یا اتصال ISG1537 ندارد.بیشتر فعل و انفعالات شناسایی شده در مطالعه ما در انتهای N پروتئین قرار داشتند، که نشان می دهد این برهمکنش ها شامل USP18 تمام قد است (شکل 4A,D) و بنابراین احتمالاً در هسته رخ می دهد.علاوه بر این، داده‌های ما همچنین نشان می‌دهد که پایانه N برای فعل و انفعالات پروتئین به پروتئین تخصصی است.محل اتصال IFNAR2 بین باقیمانده های 312-368 قرار دارد، و به ویژه، هیچ یک از پروتئین های موجود در کمپلکس به این ناحیه متصل نمی شوند (شکل 4A) 37،38.این داده ها با هم نشان می دهد که دامنه اتصال IFNAR2 منحصراً توسط پروتئین گیرنده استفاده می شود.علاوه بر این، فقط OAS3 و ROBO1 با دامنه های بالادست محل اتصال N-پایانه و IFNAR2 مرتبط هستند (شکل 4A).
ROBO1 متعلق به ابرخانواده ایمونوگلوبولین ها (Ig) مولکول های سیگنال دهنده گذرنده است و از پنج حوزه Ig و سه حوزه فیبرونکتین (Fn) در ناحیه خارج سلولی تشکیل شده است.این حوزه‌های خارج سلولی توسط یک ناحیه پروگزیمال غشایی و یک مارپیچ گذر غشایی منفرد دنبال می‌شوند. یک ناحیه داخل سلولی بدون ساختار در انتهای C قرار دارد و حاوی موتیف‌های توالی حفظ‌شده‌ای است که واسطه اتصال پروتئین عامل می‌شود.ناحیه ای که از اسیدهای آمینه ~ 1100 تا 1600 امتداد می یابد عمدتاً بی نظم است.ما دریافتیم که MX1 با ROBO1 از طریق Ig، Fn، و دامنه های درون سلولی تعامل دارد، در حالی که بیشتر برهمکنش ها با STAT1 بین CCD، دامنه پیوند دهنده و C-پایانه ROBO1 رخ می دهد (شکل 4A,E).از سوی دیگر، برهمکنش با نواحی پیوند دهنده DI، DIII و OAS3 در سراسر پروتئین ROBO1 توزیع شد (شکل 4A).
خانواده پروتئین الیگوآدنیلات سنتاز (OAS) RNA دو رشته ای داخل سلولی (dsRNA) را می پذیرد و متصل می کند، تحت تغییرات ساختاری قرار می گیرد و الیگوآدنیلات های مرتبط با 2'،5' (2-5 As) را سنتز می کند.مشخص شد که در بین سه OAS، OAS3 بالاترین میل ترکیبی را برای dsRNA نشان می‌دهد و کمترین مقدار 2-5 As را سنتز می‌کند، که می‌تواند RNase L را فعال کرده و در نتیجه تکثیر ویروس را محدود کند.خانواده OAS شامل حوزه‌های ترانسفراز نوکلئوتیدی شبه پلیمراز بتا (pol-β) است.تحقیقات قبلی نشان داده است که فعالیت کاتالیزوری دامنه C ترمینال (DIII) وابسته به دامنه اتصال dsRNA (DI) است که برای فعال سازی OAS342 مورد نیاز است.ما مشاهده کردیم که حوزه های DI و DII OAS3 با CCD و یک ناحیه اتصال کوچک بین SH2 و STAT1 TAD تعامل دارند (شکل 4A,F).پوشاندن محل‌های اتصال عرضی مختلف بر روی ساختار پروتئین، برهم‌کنشی بین صفحه β و حلقه DBD STAT1 و یک پاکت یا حفره باز ایجاد شده توسط باقی‌مانده‌های 60-75 در حوزه DI OAS3 را نشان داد (شکل 4G).جهت گیری پروتئین ها در مجموعه همچنین نشان داد که هیچ یک از برهمکنش ها با OAS3 با توانایی اتصال به DNA دامنه DI آن تداخل ندارد (شکل S1A).علاوه بر این، دامنه N ترمینال GTPase MX1 به طور گسترده با حوزه های DI و DIII OAS3 تعامل دارد (شکل 4A).ما همچنین یک تعامل بین OAS1 و MX1 را در هر سه تکرار تحت درمان با IFNα مشاهده کردیم، که در آن یک دامنه OAS1 منفرد (همچنین از نظر کاتالیزوری فعال) با هر سه دامنه MX1 تعامل داشت (شکل S2A,B).
پروتئین‌های MX بخشی از یک خانواده بزرگ از GTPaseهای شبه داینئین هستند که حاوی یک دامنه N ترمینال GTPase است که GTP را متصل می‌کند و هیدرولیز می‌کند، یک دامنه میانی که خود مونتاژ را واسطه می‌کند، و یک زیپ لوسین C ترمینال که به عنوان GTPase عمل می‌کند (LZ) ).دامنه تأثیرگذار دامنه25،43.MX1 به زیر واحدهای پلیمرازهای ویروسی متصل می شود تا رونویسی ژن ویروسی را مسدود کند.یک صفحه نمایش دو هیبریدی مخمری که قبلا گزارش شده بود نشان داد که MX1 مرتبط با PIAS1 با مسدود کردن فعالیت اتصال به DNA، فعال شدن ژن با واسطه STAT1 را مهار می کند و همچنین دارای فعالیت لیگاز SUMO E344,45 است.در اینجا، ما نشان می‌دهیم که MX1 به STAT1 متصل می‌شود (شکل 4C، D)، اما اینکه چگونه این تعامل بر فعال‌سازی ژن با واسطه STAT1 در پاسخ به IFNα تأثیر می‌گذارد، نیاز به مطالعه بیشتر دارد.علاوه بر این، ما همچنین دریافتیم که MX1 با IFIT3 و DDX60 در هر سه تکرار تحت درمان با IFNα تعامل داشت (شکل S2C).
DDX60 یک هلیکاز سیتوپلاسمی ناشی از IFN است که قبلاً گزارش شده بود که در تخریب مستقل از RIG-I RNA46 ویروسی نقش دارد.این با RIG-I تعامل می کند و سیگنال دهی خود را به شیوه ای خاص لیگاند فعال می کند.بیشتر برهمکنش های آن با MX1 و IFIT3 در نواحی طولانی ترمینال N و C بدون حوزه ها یا موتیف های متعارف رخ می دهد (شکل S2E,F).با این حال، MX1 همچنین با دامنه هلیکاز DEXD/H-Box مرتبط است (شکل S2E).پروتئین‌های خانواده IFIT دارای نسخه‌های پشت سر هم از یک موتیف متمایز مارپیچ چرخشی به نام تکرار تتراپپتید (TPR) هستند.مشخص شد که IFIT3 یک تعدیل کننده مثبت سیگنالینگ RIG-I و از این رو جزء مجموعه MAVS است.روی هم رفته، داده‌های ما نشان می‌دهد که IFIT3 و DDX60 عمدتاً در ناحیه بین TPR 3-6 IFIT3 با هم تعامل دارند و ممکن است در سیگنال‌دهی RIG-I/MAVS نقش داشته باشند (شکل S2F).
با توجه به اینکه غربالگری کل پروتئوم از نظر محاسباتی فشرده است، سپس کل پایگاه داده UniProt انسانی را برای حضور یکی از تکرارهای درمان شده با IFNα غربال کردیم.در این ماکت، چندین شبکه تعاملی بسیار قابل اعتماد برای HLA-A پیدا کردیم.تجزیه و تحلیل مسیرهای پروتئینی شناسایی شده توسط طیف MS/MS نشان داد که پردازش و ارائه آنتی ژن مبتنی بر MHC-I مسیر اصلی القا شده توسط اینترفرون است (شکل 3D).بنابراین، ما بر مطالعه برهمکنش‌های پروتئینی مولکول‌های MHC-I با درجه اطمینان بالا در تمام نمونه‌های دارای پیوند متقابل تمرکز کردیم.HLA از حوزه های α1، α2 و α3 و زنجیره های سبک تشکیل شده است و میکروگلوبولین β2 (β2m) یک پروتئین چپرون ثابت است49.پس از مونتاژ در شبکه آندوپلاسمی، HLA در غیاب لیگاندهای پپتیدی ناپایدار است.شیار اتصال به پپتید توسط حوزه‌های α1 و α2 بسیار چندشکل و بدون ساختار به شکل غیر پپتیدی و دامنه نسبتاً کم‌تر α351 چندشکلی تشکیل می‌شود.در حضور IFNα، ما دو کمپلکس HLA-A را تشخیص دادیم: یکی با HMGA1 و H2B (شکل 5، جدول S3) و دیگری با MDN1، LRCH4 و H2B تعامل دارد (شکل 6).
IFNα یک شبکه تعامل HLA-A با H2B (H2BFS) و HMGA1 القا می کند.(الف) طرح دوبعدی (تولید شده در نرم افزار SIM-XL) که انواع مختلفی از تعاملات را در مجموعه H2B-HLA-A-HMGA1 نشان می دهد: پیوند (آبی)، پیوند بین (قرمز) و پیوند واحد (سیاه)..دامنه‌هایی با هویت‌های مختلف دارای کد رنگی 32 هستند: H2B (هیستون؛ 2-102) و MHC-I (MHC_1؛ 25-203، گروه C1؛ 210-290 و MHC_I_C؛ 337-364).آستانه پیوند متقابل 3.5 تعیین شد.نمودارهای نقطه‌ای نشان‌دهنده مکان‌های تعامل HLA-A با H2B (B) و HMGA1 (C)، و همچنین مکان‌های تعامل K یا S بین دو پپتید است.در شکل، آستانه امتیاز پیوند متقابل 3.0 تعیین شده است.(د) روابط بین پروتئین های نشان داده شده در ساختار پروتئین های H2B، HLA-A و HMGA1 در برنامه PyMOL.این ساختارها با استفاده از سرور Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) مدل‌سازی شدند و ساختارهای الگو برای پروتئین‌های H2B، HLA-A و HMGA1 به ترتیب 1kx552، 1kj349 و 2eze55 بودند.
IFNα یک شبکه تعامل HLA-A با H2B (H2BFS)، MDN1 و LRCH4 القا می کند.(الف) پیوندهای عرضی درون مولکولی (قرمز) و بین مولکولی (آبی) بر روی یک نقشه تعاملی دوبعدی (تولید شده در نرم افزار SIM-XL) با MDN1 که به صورت دایره نشان داده شده است.آستانه پیوند متقابل 3.5 تعیین شد.دامنه هایی با هویت های مختلف دارای کد رنگی 32 هستند: H2B (هیستون؛ 2-102)، MHC-I (MHC_1؛ 25-203، گروه C1؛ 210-290 و MHC_I_C؛ 337-364) و LRCH4 (LRR_8 (68-126)، LRR_8 (137-194) و CH (535-641)).(B) روابط بین پروتئین های نشان داده شده در ساختار پروتئین های H2B، HLA-A، LRCH4، و MDN1 در برنامه PyMOL.این ساختارها با استفاده از سرور Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) با ساختارهای قالب 1kx552، 1kj349، 6hlu62 و 6i2665 برای پروتئین‌های H2B، HLA-A، LRCH4 و MDN1 مدل‌سازی شدند. به ترتیب.نمودارهای نقطه‌ای که مکان‌های تعامل K یا S را برای HLA-A با H2B (C)، LRCH4 (D) و MDN1 (E) نشان می‌دهند.برای نمودارها، آستانه امتیاز پیوند متقابل روی 3.0 تنظیم شد.
هیستون H2B علاوه بر حفظ یکپارچگی ژنوم، در تنظیم رونویسی نیز نقش دارد.پروتئین H2B از یک دامنه هیستون مرکزی (HFD) تشکیل شده است که توسط سه مارپیچ α که توسط حلقه ها و یک دم C ترمینال 41،52 جدا شده اند تشکیل شده است.بیشتر برهمکنش با H2B در مارپیچ α1 رخ می‌دهد که با هترودایمر HFD سه‌شدن را فراهم می‌کند (شکل 5A,B).اگرچه لیزین ها در اتصال DNA نقش دارند، برخی از لیزین ها نیز مکان های جایگزین استیلاسیون یا متیلاسیون هستند.به عنوان مثال، باقیمانده‌های K43، K46، و K57 از H2B در اتصال مستقیم DNA نقشی ندارند، اما اهداف تغییرات مختلف پس از رونویسی هستند.به طور مشابه، باقیمانده های K44، K47، و K57 در H2B ممکن است نقش جایگزینی در حضور IFNα، از جمله برهمکنش با سایر پروتئین ها داشته باشند (شکل 5A، B).علاوه بر این، هیستون H2B خارج کروموزومی پاسخ ایمنی را در انواع مختلف سلول فعال می کند و به عنوان یک حسگر سیتوزولی برای شناسایی قطعات DNA دو رشته ای (dsDNA) مشتق شده از عوامل عفونی یا سلول های آسیب دیده عمل می کند.در حضور ویروس های DNA، کاهش H2B تولید IFN-β و فسفوریلاسیون STAT154 را مهار کرد.H2B همچنین شناخته شده است که سریعتر از سایر هیستونهای هسته به داخل و خارج از هسته حرکت می کند.برهمکنش های H2B با MDN1 و LRCH4 نیز در نمونه های منتخب تیمار نشده مشاهده شد.ما دریافتیم که HLA-A با H2B در هر سه نمونه تیمار شده با IFNα و در یک نمونه تکراری درمان نشده برهمکنش داشت.این داده ها نقش H2B را در یک عملکرد فیزیولوژیکی جایگزین مستقل از مقررات رونویسی منعکس می کنند.
HMGA1 (گروه تحرک بالا AT-Hook 1)، یک نوکلئوپروتئین کوچک غنی از اسیدهای آمینه محرک بیماری، در ارتباط با HLA-A شناسایی شده است.دارای یک دم اسیدی C ترمینال و سه DBD مجزا به نام قلاب AT است زیرا آنها به شیار کوچک ناحیه غنی از AT در dsDNA55,56 متصل می شوند.این اتصال باعث خم شدن یا راست شدن DNA می شود و به فاکتورهای رونویسی متعارف اجازه می دهد تا به توالی اجماع آن دسترسی پیدا کنند.اعتقاد بر این است که دم C ترمینال در فعل و انفعالات پروتئین-پروتئین و جذب فاکتورهای رونویسی دخیل است، زیرا جهش یافته های حذف ترمینال C قادر به شروع رونویسی نیستند.علاوه بر این، این دامنه حاوی چندین محل فسفوریلاسیون حفاظت شده است که سوبستراهای شناخته شده برای کینازها هستند.ما تعاملات HLA-A و H2B را با HMGA1 در خارج از دامنه C ترمینال مشاهده کردیم، که نشان می دهد دامنه C ترمینال عمدتاً برای اتصال فاکتور رونویسی استفاده می شود (شکل 5A, C).پروتئین های HMGA برای اتصال به DNA آداپتور با هیستون H1 رقابت می کنند و در نتیجه دسترسی را افزایش می دهند.به طور مشابه، به نظر می رسد احتمال دارد که HMGA با هیستون H2B در امتداد DNA پیوند دهنده در رقابت با هیستون H1 تعامل داشته باشد.HMGB1 بیان HLA-A، -B و -C را در سلول‌های دندریتیک القا می‌کند که منجر به فعال‌سازی آنها می‌شود، اما تعامل بین HMG و HLA قبلاً گزارش نشده است.ما دریافتیم که HMGA1 با حوزه‌های α1 و α3 HLA-A، با بیشتر برهمکنش‌ها خارج از 3 DBD آن تعامل دارد (شکل 5A,C).در دست ما مشخص شد که HLA-A در هسته قرار دارد (داده‌ها نشان داده نشده است) و با توجه به اینکه H2B و HMGA1 نیز در هسته وجود دارند، این تعامل احتمالاً در هسته رخ می‌دهد.ترکیبات اضافی خاص اندازه گیری شده بین H2B، HLA-A و HMGA1 در شکل 5D نشان داده شده است.
بیشتر فعل و انفعالات HLA-A با سایر پروتئین ها در حوزه های α1 و α2 و دامنه C ترمینال نامنظم رخ می دهد (شکل 6).در یکی از این مثال‌ها، متوجه شدیم که HLA-A با دم ترمینال نامنظم LRCH4 تعامل دارد (شکل 6A,D).LRCH4 فعال سازی TLR4 و القای سیتوکین LPS را تنظیم می کند، در نتیجه پاسخ ایمنی ذاتی را تعدیل می کند60،61.این یک پروتئین غشایی با 9 تکرار غنی از لوسین (LRRs) و یک موتیف همسانی کالمودولین (CH) در اکتودومین آن است و به دنبال آن یک دامنه گذرنده (TMD) 60، 62 است.گزارش شده است که دامنه های CH واسطه تعاملات پروتئین-پروتئین هستند 60 .کشش حدود 300 اسید آمینه بین دامنه های LRR و CH نسبتاً در دسترس است اما بی نظم است.بر اساس عملکرد مناطق بی نظم به عنوان واسطه شبکه های پروتئین-پروتئین و حمل و نقل تاولی 63، ما دریافتیم که بیشتر فعل و انفعالات پروتئین در مناطق بی نظم اتفاق می افتد.فعل و انفعالات با MDN1 در طول پروتئین، از جمله دامنه های LRR1، LRR6، CH و مناطق تصادفی توزیع شد، در حالی که H2B عمدتا به دامنه CH متصل می شود (شکل 6A، B).قابل ذکر است، هیچ یک از تعاملات شامل TMJ نمی شود، که ویژگی رویکرد CLMS را نشان می دهد (شکل 6A، B).
MDN1 همچنین به عنوان بخشی از شبکه پروتئین HLA-A شناسایی شده است (شکل 6A).به خانواده پروتئین های AAA (ATPases مرتبط با فعالیت های مختلف) تعلق دارد.این همان دامنه N ترمینال AAA است که در یک حلقه هگزامری سازماندهی می شود و فاکتور مونتاژ را از زیر واحد ریبوزومی 60S 64 حذف می کند.به نظر می رسد شبیه به dynein64,65,66 باشد.علاوه بر این، منطقه غنی از Asp/Glu توسط دامنه MIDAS (سایت وابسته به یون فلز) دنبال می‌شود.با توجه به اندازه بزرگ MDN1 (تقریباً 5600 اسید آمینه) و همسانی محدود آن با پروتئین های به خوبی مطالعه شده، اطلاعات کمی در مورد ساختار و عملکرد آن در انسان وجود دارد.ما HLA-A، H2B، و LRCH4 را به عنوان شرکای اتصال MDN1 شناسایی کردیم و جهت گیری آنها را به عنوان مجتمع های پروتئینی در PyMol نشان دادیم (شکل 6A،B).این سه پروتئین با دامنه AAA، دامنه پیوند دهنده شبه dynein و احتمالاً دامنه MIDAS MDN1 تعامل دارند.در گزارش قبلی، خالص‌سازی ترکیبی پروتئین‌های طعمه، MDN1 را به عنوان یک پروتئین مرتبط با هیستون H2B67 شناسایی کرد.علاوه بر این، یک مطالعه اخیر نیز تعامل بین MDN و HLA-B در سلول‌های HCT116 را با استفاده از طیف‌سنجی جرمی خالص‌شده با میل ترکیبی گزارش کرده است که از یافته‌های ما پشتیبانی می‌کند.شناسایی این کمپلکس در نمونه های تیمار شده با IFNα نقشی را برای MDN1 در سیگنال دهی اینترفرون نشان می دهد.
از آنجایی که ژن‌های HLA بسیار چندشکلی هستند، ما از داده‌های توالی‌یابی RNA سلول‌های Flo-1 (داده‌ها نشان داده نشده‌اند) نقشه‌برداری HLA-A، -B و -C را از توالی‌یابی استخراج کردیم.توالی های پپتیدی مطابق با خواندن توالی، تفاوت های قابل توجهی را بین HLA-A، -B، و -C در مناطقی که پپتیدهای پیوند متقابل در HLA-A قرار داشتند نشان داد (شکل S3).علاوه بر این، ما اتصال عرضی پروتئین به پروتئین مولکول های HLA-B/C با پروتئین های H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 را مشاهده نکردیم.این نشان می دهد که برهمکنش پروتئین موجود بین HLA-A، MDN1، LRCH1 و HMGA1 اختصاصی HLA-A است.علاوه بر این، آنالیز پروتئومی نمونه‌های بدون پیوند متقابل (جدول S4) نشان داد که HLA-A پوشش توالی بالاتری در مقایسه با HLA-B یا HLA-C دارد.پپتیدهای شناسایی شده برای HLA-A در هر دو نمونه تیمار شده با IFNα و نمونه های تیمار نشده با شدت بالا بودند.
برای اطمینان از اینکه فعل و انفعالات شناسایی شده در اینجا به دلیل اتصال متقابل غیر اختصاصی دو پروتئین در مجاورت فضایی نیست، ما بیشتر دو عامل جدید تعامل HLA-A را با انجام سنجش‌های هم‌رسوبی ایمنی تأیید کردیم.برهمکنش های HLA-A با MDN1 و H2B درون زا در سلول های Flo-1 تیمار شده با IFNα و درمان نشده مشاهده شد (شکل 7، شکل S4).ما تایید کردیم که HLA-A توسط H2B در رسوبات ایمنی گرفته شده است و این ارتباط به دلیل درمان IFNα است زیرا HLA-A در نمونه های رسوب ایمنی سلول های تیمار نشده وجود ندارد (شکل 7A).با این حال، داده های ما نشان می دهد که IFNα اتصال HLA-A به H2B و MDN1 را به طور متفاوت تنظیم می کند.IFNα باعث ایجاد ارتباط بین H2B و HLA-A می شود، اما ارتباط آن را با MDN1 کاهش می دهد.ما دریافتیم که MDN1 با HLA-A در گروه کنترل مرتبط است، و افزودن IFNα این تعامل را مستقل از القای MDN1 توسط IFNα کاهش داد (شکل 7B,C).علاوه بر این، رسوب ایمنی HLA-A H2B را در سلول‌های A549 جذب کرد (شکل S4)، که نشان می‌دهد این تعامل مستقل از نوع سلول است.در مجموع، این نتایج از تعاملات با واسطه اینترفرون HLA-A با H2B و MDN1 پشتیبانی می کند.
HLA-A H2B و MDN1 را تصفیه می کند.ایمونوبلات‌های درون‌زای H2B (A) و MDN1 (B) از سلول‌های Flo-1 تیمار شده با IFNα رسوب داده شدند و برای آنتی‌بادی‌های نشان‌داده‌شده بررسی شدند.IgG موش و خرگوش به عنوان کنترل منفی استفاده شد.(C) مقادیر نسبی (ورودی) آنتی ژن‌های مختلف توسط بلات‌های ایمونوبلاتی که در برابر آنتی‌بادی‌های مشخص‌شده کاوش می‌شوند، نشان داده می‌شوند، β-اکتین به‌عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد.
ویژگی‌های ساختاری یکی از شبکه‌های پیوند متقابل بسیار قابل اعتماد ناشی از اینترفرون، H2B-HLA-A-HMGA1، مورد بررسی قرار گرفت.ما از مدل‌سازی دینامیک مولکولی به عنوان یک رویکرد جایگزین برای درک دینامیک ساختاری پروتئین‌های درگیر در این مجموعه استفاده کردیم (شکل 8).استنباط از داده های CLMS امکان ترکیب های مختلف پروتئین های H2B، HLA-A و HMGA1 را نشان می دهد.بنابراین، مجتمع‌های بالقوه زیر در محیط حلال مدل‌سازی شدند: H2B-HLA-A، HMGA1-HLA-A، و H2B-HLA-A-HMGA1.یک صفحه اتصال اولیه پروتئین-پروتئین با استفاده از بسته MOE (محیط عملیاتی مولکولی؛ Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ترکیبات احتمالی را پیشنهاد کرد که بین این پروتئین ها متفاوت است (شکل 8A).تجسم کمپلکس پروتئین داکینگ چندین برهمکنش و ترکیبات احتمالی را نشان داد (شکل 5A، 8).بنابراین، یک ترکیب احتمالی در شکل 8A نشان داده شده است (با پیوندهای متقاطع نشاندار شده) و بیشتر با استفاده از خط لوله مدلسازی MD مورد ارزیابی قرار گرفت.علاوه بر این، اتصال H2B یا HMGA1 به HLA-A میل ترکیبی بالاتر H2B برای HLA-A را برجسته می کند (شکل 8A).
دینامیک ساختاری شبکه های ممکن بین مجتمع های H2B (H2BFS)-HLA-A، HMGA1-HLA-A، و H2B-HLA-A-HMGA1.(الف) پانل سمت چپ یک نقشه دوبعدی (تولید شده در نرم افزار SIM-XL) از پیوندهای عرضی درون مولکولی (قرمز) و بین مولکولی (آبی) (قطع اتصال متقاطع بر روی 3.5 تنظیم شده است).علاوه بر این، بقایای پیوند متقابل شناسایی شده بر روی ساختارهای پروتئین های H2B، HLA-A و HMGA1 برچسب گذاری می شوند.ترکیبات مرتبط این پروتئین ها با استفاده از خط لوله اتصال پیاده سازی شده در بسته MOE استخراج شد.پانل پایین سمت چپ، ترکیب‌های احتمالی مختلف کمپلکس‌های H2B-HLA-A و HMGA1-HLA-A را با شباهت‌های مختلف اتصال پروتئین به پروتئین نشان می‌دهد (GBVI/WSA dG؛ kcal/mol).(ب) انحراف استاندارد (RMSD) موقعیت‌های اتمی (به استثنای اتم‌های هیدروژن) برای هر ساختار پروتئین.(C) برهمکنش‌های پیوند هیدروژنی پروتئین-پروتئین بین مولکولی از مجتمع‌های شبیه‌سازی‌شده مختلف با در نظر گرفتن برهم‌کنش‌های خاص با مدت زمان ≥ 10 ns.فاصله قطع دهنده-گیرنده پیوند h روی 3.5 Å تنظیم شد و زاویه قطع دهنده-H-گیرنده روی ≥ 160-180 درجه تنظیم شد.(D) باقیمانده‌های نشاندار شده که تعاملات پروتئین-پروتئین HLA-A را با شرکای مربوطه خود تشکیل می‌دهند، که ≥ 20 ns را در بر می‌گیرد و از مجتمع‌های ساختگی HLA-A-H2B و HLA-A-HMGA1 استخراج می‌شود.ساختارهای پروتئینی ساختار متوسط ​​100 ns MDS را نشان می دهند.(E) برهمکنش‌های بین کمپلکس‌های HLA-A-H2B و HLA-A-HMGA1 در مقایسه با برهمکنش‌هایی که توسط شبیه‌سازی H2B-HLA بیش از 100 ns بر اساس مکان تعامل K یا S بین دو پپتید ردیابی می‌شوند.مجتمع ها /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.مقدار آستانه برای ارزیابی پیوندهای متقابل روی 3.0 تنظیم شد و برهمکنش های خاص از MDS که ≥ 10 ns در نظر گرفته شد در نظر گرفته شد.ساختارهای پروتئین با استفاده از بسته‌های BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) و محیط عملیاتی مولکولی (MOE؛ Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) تجسم شدند.
پایداری مولکول‌های HLA-A در طول زمان (انحراف استاندارد؛ RMSD یا انحراف استاندارد؛ RMSF) نشان داد که وجود پروتئین‌های H2B یا HMGA1 در کمپلکس‌ها HLA-A را تثبیت می‌کند (شکل 8B، شکل S5).پروتئین HMGA1 محکم به محل B2M HLA-A متصل می شود و باعث ایجاد ثبات اسیدهای آمینه HLA-A در کمپلکس HLA-A-HMGA1 یا H2B-HLA-A-HMGA1 می شود (شکل 8B، شکل S5).به طور خاص، باقی مانده های HLA ~60-90 و ~180-210 در حضور H2B انعطاف پذیری کمتری دارند (شکل 8B).H2B و HMGA1 اتصال بهتری به HLA-A در کمپلکس H2B-HLA-A-HMGA1 در مقایسه با اتصال HLA-A به H2B یا HMGA1 به تنهایی نشان دادند (شکل 8C،D؛ جدول S5).باقیمانده‌های درگیر در پیوند هیدروژنی (مدل‌سازی شده MD با اشغال بالا ≥ 10 ns) با مکان‌های برهمکنش CLMS (باقی‌مانده‌های K یا S) در مجموعه منطبق است، که نشان می‌دهد برهمکنش‌های شناسایی‌شده توسط CLMS بسیار قابل اعتماد هستند.قابلیت اطمینان (شکل 8E).در مدلسازی CLMS و MD، باقیمانده های HLA-A بین 190-210 و حدود 200-220 اسید آمینه به ترتیب برای اتصال به H2B و HMGA1 یافت شد (شکل 8E).
فعل و انفعالات پروتئین-پروتئین شبکه های ساختاری پویا را تشکیل می دهند که ارتباطات درون سلولی را در پاسخ به محرک های خاص واسطه می کنند.از آنجایی که بسیاری از رویکردهای پروتئومیکس تغییرات در سطح کلی حالت پایدار یک پروتئین را تشخیص می‌دهند، دینامیک تعامل پروتئین-پروتئین به ابزارهای اضافی برای گرفتن رابط‌های اتصال نیاز دارد و CLMS یکی از این ابزارها است.سیستم سیگنال دهی اینترفرون یک شبکه سیتوکین است که به سلول ها اجازه می دهد تا به طیف وسیعی از سیگنال های پاتولوژیک بیماری زا و ذاتی محیطی پاسخ دهند و به القای زیر مجموعه هایی از پروتئین های القایی با اینترفرون ختم می شود.ما از CLMS برای تعیین اینکه آیا می‌توان برهم‌کنش‌های جدید پروتئین-پروتئین را در میان گروهی از پروتئین‌های القا شده با اینترفرون شناسایی کرد، از CLMS استفاده کردیم.تجزیه و تحلیل اتصال متقابل پروتئین جهانی در یک مدل سلولی Flo-1 پاسخگو به اینترفرون برای گرفتن مجتمع های پروتئینی استفاده شد.استخراج پپتیدهای تریپتیک از سلول‌های بدون پیوند متقابل و متقابل امکان شمارش پپتید، غنی‌سازی مسیر و توزیع طول پپتید با شدت LFQ مشخص را می‌دهد.پروتئین‌های متعارف القایی با اینترفرون به‌عنوان یک کنترل داخلی مثبت شناسایی شدند، در حالی که ترکیب‌های ترکیبی جدید بین مولکولی و درون مولکولی از پروتئین‌های متعارف القایی با اینترفرون مانند MX1، UP18، OAS3 و STAT1 مشاهده شدند.ویژگی‌های ساختاری و تعاملات مختلف در حوزه‌های عملکردی مورد بررسی قرار گرفته‌اند.
یک تعامل بین HLA-A، MDN1 و H2B با بلات در سلول‌های Flo-1 و A549 تحت درمان و درمان نشده با IFNα شناسایی شد.نتایج ما نشان می‌دهد که HLA-A با H2B به شیوه‌ای وابسته به IFNα کمپلکس می‌شود.کار ما راه جالبی برای اکتشاف بیشتر در مورد محلی سازی مشترک این دو مجموعه است.همچنین گسترش رویکرد CLMS به پانلی از خطوط سلولی برای شناسایی تعاملات پروتئینی با واسطه اینترفرون مستقل از نوع سلولی نیز جالب خواهد بود.در نهایت، ما از مدل‌سازی MD به عنوان یک رویکرد جایگزین برای درک پویایی ساختاری پروتئین‌های دخیل در کمپلکس H2BFS-HLA-A-HMGA1 استفاده کردیم که گفتگوهای متقابل درون مولکولی و بین مولکولی را دنبال می‌کرد.استنتاج از داده‌های CLMS احتمال ترکیب‌های مختلف پروتئین‌های H2BFS، HLA-A و HMGA1 را نشان می‌دهد.ترکیب‌های مختلف احتمالی بین این مجتمع‌های پروتئینی اتصال، چندین تعامل مشابه با آنچه در مجموعه داده CLMS مشاهده شد را نشان داد.یکی از نقاط قوت اصلی روش ما این است که امکان شناسایی آسان ژن‌های دارای چندشکلی بالا مانند HLA را فراهم می‌کند، بنابراین مطالعه برهم‌کنش‌های پروتئین‌های اختصاصی هاپلوتیپ HLA که در غیر این صورت مطالعه آنها دشوار است، جالب خواهد بود.در مجموع، داده‌های ما نشان می‌دهد که CLMS می‌تواند برای گسترش درک ما از شبکه‌های سیگنالینگ ناشی از اینترفرون استفاده شود و مبنایی برای مطالعه سیستم‌های پیچیده‌تر بین سلولی در ریزمحیط تومور فراهم کند.
سلول های Flo-1 از ATCC به دست آمد و در DMEM (Gibco) همراه با 1٪ پنی سیلین / استرپتومایسین (Invitrogen)، 10٪ سرم جنین گاو (Gibco) نگهداری شد و در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5٪ CO2 ذخیره شد.دوره نهفتگی یا کمون.سلول ها قبل از درمان با IFNα14 (تولید شده توسط کارخانه تولید پروتئین ادینبورگ) تا 70 تا 80 درصد تلاقی رشد کردند.تمام مواد شیمیایی و معرف های دیگر از سیگما آلدریچ خریداری شده اند، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد.
سلول‌های Flo-1 در پلیت‌های 6 چاهی کشت داده شدند و روز بعد سلول‌ها با 10 نانوگرم در میلی‌لیتر IFNα14 به مدت 24 ساعت تا حدود 80 درصد تیمار شدند.سلول ها سه بار با PBS شسته شدند و با DSS تازه آماده شده (Thermo Fisher Scientific) (محلول در DMSO) در PBS به مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد تا غلظت نهایی 0.5 میلی مولار قرار گرفتند.واکنش اتصال عرضی DSS با PBS جایگزین شد و DSS باقیمانده با افزودن 20 میلی مولار Tris (pH 8.0) در PBS به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد خاموش شد.سلول ها با تراشیدن جمع آوری و در لوله های با اتصال کم (اکسیژن) جمع آوری شدند.
گلوله سلولی با 300 میکرولیتر بافر لیز اوره (8 مولار اوره، 0.1 مولار تریس، pH 8.5) به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق با تکان دادن گاه به گاه لیز شد.تمام مراحل سانتریفیوژ در 14000 xg در 8 درجه سانتی گراد انجام شد.لیزات را به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را به یک لوله جدید منتقل کنید.ذرات شفاف باقیمانده در 150 میکرولیتر از بافر لیز دوم (2 مولار اوره، 2% (w/v) SDS (سدیم دودسیل سولفات)) به مدت 30 دقیقه یا بیشتر تا زمانی که محلول آبی همگن به دست آمد حل شدند.لیز به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی با لیز به دست آمده در مرحله قبل مخلوط شد.غلظت پروتئین با استفاده از روش Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) مطابق دستورالعمل سازنده برای روش های میکروپلیت ارزیابی شد.نمونه ها به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند و در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
تقریباً 100 میکروگرم پروتئین پیوند متقابل محلول با استفاده از پروتکل آماده سازی نمونه فیلتراسیون اصلاح شده (FASP) همانطور که توسط Wisniewski و همکارانش توضیح داده شد، پردازش شد.69 به طور خلاصه، پروتئین با 200 میکرولیتر بافر اوره (8 مولار اوره در 0.1 مولار تریس، pH 8.5)، ورتکس شده و نصف می شود.تمام مراحل سانتریفیوژ در 14000 xg در دمای 25 درجه سانتی گراد انجام شد.نیمه اول لیز پروتئین با پیوند متقابل به یک دستگاه فیلتر گریز از مرکز Microcon 10 کیلو دالتون مجهز به غشای Ultracel-10 (Merck) منتقل شد و سپس سانتریفیوژ روی فیلتر به مدت 25 دقیقه انجام شد.سپس نیمه دوم پروتئین را به فیلتر اضافه کنید و همین مراحل را تکرار کنید.بازیابی پروتئین با افزودن 100 میکرولیتر 17 میلی مولار تریس (2-کربوکسی اتیل) فسفین هیدروکلراید (TCEP) در بافر اوره انجام شد.ریکاوری روی ترمومیکسر با سرعت 600 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد همزد شد.علاوه بر این، ستون سانتریفیوژ شد و پروتئین پیوند متقابل کاهش یافته با استفاده از 100 میکرولیتر 50 میلی مولار یدوااستامید در بافر اوره آلکیله شد.واکنش آلکیلاسیون در دمای اتاق به مدت 20 دقیقه در تاریکی انجام شد.ستون را بچرخانید، دیواره های ستون را 3 بار با 100 میکرولیتر بافر اوره بشویید و سپس سانتریفیوژ کنید.همین عمل 3 بار با استفاده از 100 میکرولیتر بی کربنات آمونیوم 100 میلی مولار انجام شد.قبل از تریپسینیزاسیون، لوله جمع آوری را با یک لوله جدید جایگزین کنید.بافر هضم حاوی 50 میلی مولار بی کربنات آمونیوم و 1 میکرولیتر تریپسین رقیق شده در بافر تریپسین (Promega) را اضافه کنید.نسبت تریپسین به پروتئین در حدود 1:33 حفظ شد و واکنش های هضم یک شبه در دمای 37 درجه سانتی گراد در یک محفظه مرطوب انکوبه شدند.پپتید متقاطع با سانتریفیوژ به مدت 25 دقیقه از فیلتر شسته شد.بازیابی پپتید با افزودن 50 میکرولیتر NaCl 0.5 مولار به فیلتر و سپس سانتریفیوژ به مدت 25 دقیقه بهبود یافت.
ستون‌های میکرو اسپین C18 (دستگاه هاروارد) برای نمک‌زدایی از پپتیدهای تریپتیک با پیوند متقابل به دنبال پروتکل توصیف‌شده توسط Bouchal و همکاران 70 با تغییرات جزئی استفاده شد.به طور خلاصه، ستون‌های اسپین C18 با سه شستشو 0.1٪ اسید فرمیک (FA) در استونیتریل (AcN) (Merck) و دو شستشو 0.1٪ FA فعال شدند.ستون با 0.1٪ FA به مدت 15 دقیقه هیدراته شد.نمونه ها را در ستون های چرخشی بارگذاری کنید و 3 بار با 0.1% FA شستشو دهید.پپتیدهای نمک زدایی شده به ترتیب با گرادیان گام به گام با استفاده از 50، 80 درصد و 100 درصد AcN در 0.1 درصد FA شسته شدند.نمونه ها در یک غلیظ کننده SpeedVac Plus (Eppendorf) خشک شدند تا مایع باقیمانده به طور کامل ناپدید شود.پپتیدهای شسته شده در 100 میکرولیتر تری فلوئورواستیک اسید 0.08 درصد در 2.5 درصد AcN حل شدند و غلظت ها بر روی NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) اندازه گیری شد.تقریباً 1 میکروگرم از پپتید متقاطع در هر نمونه به سیستم LC-MS/MS تزریق شد.
پپتیدهای متقاطع بر روی یک سیستم UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) متصل به طیف‌سنج جرمی Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) جدا شدند.پپتیدهای متقاطع بر روی یک ID 300 میکرومتری، ستون ضبط C18 قبل از ستون به طول 5 میلی‌متر که با جاذب C18 PepMap100 و جاذب 5 میکرومتری PepMap (Thermo Scientific) جمع‌آوری شد.جریان پمپ را با 5 میکرولیتر در دقیقه 0.08٪ تری فلوئورواستیک اسید حل شده در 2.5٪ AcN بارگذاری کنید.پپتیدهای متقاطع بر روی یک ستون سیلیس ذوب شده تحلیلی با قطر داخلی 75 میکرومتر و طول 150 میلی متر، پر شده با یک جاذب PepMap 2 میکرومتر (Thermo Scientific) جدا شدند.فازهای متحرک A و B به ترتیب شامل 0.1٪ FA در آب و 0.1٪ FA در استونیتریل بودند.گرادیان از 2.5٪ B شروع می شود و به صورت خطی به 40٪ B در 90 دقیقه و سپس به 90٪ B در 2 دقیقه بعدی افزایش می یابد.ترکیب فاز متحرک به مدت 10 دقیقه در 90٪ B حفظ شد و سپس به صورت خطی به 2.5٪ B در مدت 2 دقیقه کاهش یافت.ستون در 2.5% B به مدت 8 دقیقه قبل از چرخه بعدی متعادل شد.پپتیدهای متقاطع شسته شده از ستون تحلیلی در منبع یونیزاسیون نانوالکترواسپری (NSI) یونیزه شدند و به طیف سنج جرمی Exploris 480 (Thermo Scientific) تزریق شدند.
طیف‌سنج جرمی Orbitrap Exploris 480 در حالت همبستگی داده‌های مثبت کار می‌کرد.اسکن کامل در حالت بخش با وضوح 120000 با تنظیمات محدوده از m/z 350 Th تا m/z 2000 Th انجام شد.هدف نرمال شده AGC روی 300٪ با حداکثر زمان ورودی 50 میلی ثانیه تنظیم شد.تشخیص اوج تک ایزوتوپی برای پپتیدها ایجاد شده است.اگر پیش سازهای کمی یافت شوند، پارامتر آرامش محدودیت روی true تنظیم می شود.حداقل قدرت یونی پیش ساز روی 5.0e3 تنظیم شد و حالت های بار پیش ساز تا 8+ در آزمایش ها گنجانده شد.
زمان چرخه بین اسکن های اصلی در حالت همبستگی داده ها روی 2.5 ثانیه تنظیم شد.طرد جرم پویا به 20 ثانیه پس از اولین قطعه قطعه شدن یون پیش ساز تنظیم شد.پنجره جداسازی پیشرو روی 2 Th تنظیم شد.نوع انرژی برخورد نرمال شده با حالت انرژی برخورد ثابت در اسکن MS/MS وابسته به داده انتخاب شد.انرژی برخورد روی 30 درصد تنظیم شده است.وضوح Orbitrap روی 15000 و هدف AGC روی 100٪ تنظیم شد.حداکثر زمان تزریق سفارشی روی 60 میلی ثانیه تنظیم شده است.
قبل از ردیابی شبکه پروتئین-پروتئین در نمونه های پیوند متقابل، فایل های خام را با استفاده از بسته MaxQuant (نسخه 1.6.12.0)26،27 پردازش کردیم تا پپتیدها/پروتئین های قابل ردیابی را در نمونه ها شناسایی کنیم.علاوه بر این، آنالیزهای پروتئومی مشابه بر روی نمونه‌های Flo-1 غیرمتقابل تحت درمان و تیمار نشده با IFNα انجام شد.داده های MS/MS در پایگاه داده انسانی UniProt (www.uniprot.org) (آپلود شده در 12 اوت 2020، شامل 75093 ورودی) با استفاده از موتور جستجوی داخلی Andromeda27 جستجو شد.جستجو بدون نشان دادن ویژگی آنزیم و تغییرات مختلف دآمیداسیون (N، Q) و اکسیداسیون (M) انجام شد.تحمل جرم پیش ساز در ppm 20 و یون محصول در 0.02 Da تنظیم شد.انحراف جرم اولیه و حداکثر روی 10 ppm تنظیم شد.حداکثر جرم پپتید 4600 Da و شباهت توالی بین 7 و 25 اسید آمینه (aa) تنظیم شد.تجزیه و تحلیل آماری بیشتر با استفاده از برنامه Perseus (نسخه 1.6.10.45) انجام شد.محتوای پروتئین با نرمال کردن شدت طیفی پروتئین (شدت LFQ؛ کمیت بدون برچسب)27 محاسبه شد و مقادیر شدت به Log2 تبدیل شدند.یک خوشه‌بندی سلسله مراتبی از پروتئین‌ها که با شدت پپتید آن‌ها شناسایی شده‌اند، با استفاده از پکیج pheatmap (v1.0.12) در R (v 4.1.2) ساخته شد.تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر با استفاده از پایگاه داده مسیر Reactome برای پروتئین‌های تیمار شده با IFNα که بیش از چهار برابر در مقایسه با نمونه‌های تیمار نشده فعال شده بودند، انجام شد.
شناسایی پیوندهای متقابل شیمیایی خاص لیزین (K) یا سرین (S) مجتمع‌های پروتئینی تحت نظارت LC-MS/MS با استفاده از دستگاه شناسایی طیف‌سنجی (SIM-XL) برای پپتیدهای متقاطع (SIM-XL)29 انجام شد.ابتدا، برهمکنش‌های احتمالی بین ژن‌های امضای مقاومت به آسیب DNA (IRDS) مرتبط با اینترفرون (IFN) با استفاده از مجموعه داده‌های پروتئین IRDS که در Padariya و همکارانش شرح داده شده است، بررسی شد.غربالگری همه شرایط و تکرارهای کل UniProt انسانی از نظر محاسباتی فشرده است، بنابراین کل پایگاه داده UniProt انسانی (www.uniprot.org) (دانلود در 12 اوت 2020، شامل 75093 ورودی است) در برابر تکرارهای تحت درمان با IFNα.یکی از فیلترهای تعامل با اعتماد بالا.این فعل و انفعالات با اهمیت بالا به دست آمده در همه تکرارها و شرایط بسط و آزمایش شدند.
در SIM-XL، DSS برای کراسلینکر (XL) استفاده شد و تغییر وزن XL و تغییر وزن به ترتیب روی 138.06 و 156.07 تنظیم شد.مکان‌های واکنش اتصال عرضی زیر در نظر گرفته می‌شوند: KK، KS و KN-TERM، بدون یون گزارشگر.هر دو ppm پیش ساز و قطعه روی 20 و آستانه Xrea روی 0.15 تنظیم شد.تریپسین کاملاً اختصاصی در نظر گرفته شد و روش تکه تکه‌سازی با انرژی بالا C-trap (HCD) اجرا شد.آستانه کاهش DB دینامیک XCorr و حداقل تعداد پپتیدها برای کاهش DB پویا به ترتیب 2.5 و 2 تنظیم شد.پارامترهای دیگر عبارتند از: احتمال مونو ایزوتوپ و قطع تصادف اوج، حداقل 4 باقیمانده AA در هر رشته و حداکثر شارژ رشته، و 3 حداکثر شکاف از دست رفته.نقشه‌های دوبعدی دو بعدی حاصل در (SIM-XL) تجزیه و تحلیل شدند و نمایش گرافیکی xQuest28 برای ساخت نقشه‌های دوبعدی استفاده شد.پیوندهای متقابل پروتئین روی ساختارهای پروتئینی در PyMol (سیستم گرافیک مولکولی PyMOL، نسخه 2.0 شرودینگر، LLC) ارائه شده است.
ساختارهای مدل پروتئینی با استفاده از سرور Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 با استفاده از اصول مدل‌سازی همسانی و اجرای "روش پنهان مارکوف" ایجاد شد.Phyre2 ساختارهای مدل را بر اساس تراز توالی با ساختارهای پروتئینی شناخته شده تولید می کند.برای پروتئین های H2BFS، HLA-A، HMGA1، LRCH4، و MDN1، ساختارهای قالب 1kx552، 1kj349، 2eze55، 6hlu62، و 6i2665 استفاده شد.علاوه بر این، ساختار AlphaFold71 MX1، UBP18 و ROBO1 نیز در نظر گرفته شد.ساختار پروتئین با استفاده از بسته ویژوالایزر BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) و بسته محیط عملیاتی مولکولی (MOE؛ Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) مشاهده شد.