347 12.7 * 1.24 میلی متر لوله سیم پیچ فولادی ضد زنگ، مکانیسم مولکولی تراکم الکترواستاتیک همزمان و انعقاد آلفا سینوکلئین و تاو

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.شما از یک نسخه مرورگر با پشتیبانی محدود CSS استفاده می کنید.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نشان می‌دهیم.
اسلایدرهایی که سه مقاله را در هر اسلاید نشان می دهند.برای حرکت در اسلایدها از دکمه های پشت و بعدی استفاده کنید یا از دکمه های کنترلر اسلاید در انتها برای حرکت در هر اسلاید استفاده کنید.

مشخصات لوله فولادی 347

347 12.7 * 1.24 میلی متر لوله سیم پیچ فولادی ضد زنگ

قطر بیرونی: 6.00 میلی متر OD تا 914.4 میلی متر OD، اندازه تا 24 اینچ NB موجود در انبار، لوله های فولادی اندازه OD موجود در انبار

محدوده ضخامت لوله SS 347: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S، SCH10S، SCH40S، SCH80S، SCH160S، و غیره (0.5-12 میلی متر) یا اندازه غیر معمولی که در صورت نیاز تنظیم شود

نوع: لوله های بدون درز SS 347 |لوله های SS 347 ERW |لوله های جوشی SS 347 |لوله های ساخته شده SS 347 |لوله های CDW SS 347، لوله های LSAW / درز جوش داده شده / دوباره ترسیم شده

شکل: لوله/لوله گرد SS 347، لوله/لوله مربع SS 347، لوله/لوله مستطیلی SS 347، لوله سیم پیچ SS 347، شکل “U” ​​SS 347، کویل پان کیک SS 347، لوله هیدرولیک SS 347

طول: تک تصادفی، تصادفی دوگانه و انتهای طول مورد نیاز: انتهای ساده، انتهای اریب، آجدار

محافظ انتهایی: درپوش پلاستیکی |نمای بیرونی: 2B، شماره 4، شماره 1، پایان آینه شماره 8 برای لوله های فولادی ضد زنگ، پایان مطابق با نیاز مشتری

شرایط تحویل: آنیل و ترشی، جلا، بازپخت روشن، کشیده سرد

بازرسی، گزارش‌های آزمایش: گواهی‌های آزمایش آسیاب، EN 10204 3.1، گزارش‌های شیمیایی، گزارش‌های مکانیکی، گزارش‌های آزمایش PMI، گزارش‌های بازرسی بصری، گزارش‌های بازرسی شخص ثالث، گزارش‌های آزمایشگاه تایید شده NABL، گزارش آزمایش مخرب، گزارش‌های آزمایش غیر مخرب

بسته بندی: بسته بندی شده در جعبه های چوبی، کیسه های پلاستیکی، نوارهای فولادی بسته بندی شده، یا طبق درخواست مشتریان

موارد ویژه: اندازه ها و مشخصات غیر از موارد فوق را می توان در صورت درخواست تولید کرد

محدوده اندازه لوله SS 347: 1/2 اینچ NB، OD تا 24 اینچ

ASTM A312 347: لوله آستنیتی جوش داده شده بدون درز و درز مستقیم که برای درجه حرارت بالا و خدمات خورنده عمومی در نظر گرفته شده است.پرکننده فلز در هنگام جوشکاری مجاز نیست.

ASTM A358 347: لوله آستنیتی جوش داده شده الکتریکی برای سرویس خورنده و/یا دمای بالا.به طور معمول فقط لوله تا 8 اینچ با این مشخصات تولید می شود.افزودن فلز پرکننده در حین جوشکاری مجاز است.

ASTM A790 347: لوله فریتی/آستنیتی (دوبلکس) بدون درز و بدون درز جوش داده شده برای خدمات خورنده عمومی، با تاکید ویژه بر مقاومت در برابر ترک خوردگی ناشی از خوردگی تنشی.

ASTM A409 347: لوله برقی با درز مستقیم یا مارپیچی با دیواره سبک آستنیتی جوش داده شده با قطر بزرگ در اندازه های 14 تا 30 اینچ با دیواره های Sch5S و Sch 10S برای خورندگی و/یا بالا.

ASTM A376 347: لوله آستنیتی بدون درز برای کاربردهای دمای بالا.

ASTM A813 347: لوله آستنیتی تک درز، تک یا دو جوش برای دمای بالا و کاربردهای خورنده عمومی.

ASTM A814 347: لوله آستنیتی جوشکاری شده سرد برای دمای بالا و خدمات خورنده عمومی.

ترکیب شیمیایی لوله های فولادی ضد زنگ 347H

خواص مکانیکی لوله فولادی ضد زنگ 347H

خواص فیزیکی لوله های فولادی ضد زنگ 347H

نمرات معادل برای لوله فولادی ضد زنگ 347H

تجمع آمیلوئید آلفا سینوکلئین (αS) مشخصه بیماری پارکینسون و سایر سینوکلئینوپاتی ها است.اخیراً، پروتئین تاو که معمولاً با بیماری آلزایمر مرتبط است، با آسیب شناسی αS مرتبط است و مشخص شده است که در ترکیبات غنی از αS موضعی دارد، اگرچه مکانیسم مولکولی تجمع این دو پروتئین نامشخص است.ما در اینجا گزارش می‌کنیم که فاز αS از طریق تراکم کمپلکس الکترواستاتیکی با پلی پپتیدهای دارای بار مثبت مانند تاو به میعانات مایع جدا می‌شود.بسته به میل ترکیبی αS برای پلی کاتیون ها و میزان کاهش ظرفیت شبکه انعقادی، لخته ها دچار ژل یا ادغام سریع و به دنبال آن تجمع آمیلوئید آهسته می شوند.با ترکیب مجموعه ای از تکنیک های بیوفیزیکی پیشرفته، ما توانستیم جداسازی فاز αS/Tau مایع-مایع را مشخص کنیم و عوامل کلیدی را که منجر به تشکیل دانه های ناهمگن حاوی هر دو پروتئین در یک میعانات پروتئینی مایع می شوند، شناسایی کنیم.
علاوه بر بخش‌های غشایی، جداسازی فضایی در سلول‌ها نیز می‌تواند با تشکیل اجسام متراکم غنی از پروتئین و مایع مانند به نام میعانات زیست مولکولی یا قطرات، از طریق فرآیندی به نام جداسازی فاز مایع-مایع (LLPS) حاصل شود.این قطرات توسط فعل و انفعالات زمانی چند ظرفیتی، معمولاً بین پروتئین‌ها یا پروتئین‌ها و RNA تشکیل می‌شوند و تقریباً در تمام سیستم‌های زنده عملکردهای مختلفی دارند.تعداد زیادی از پروتئین‌های دارای LLP توالی‌هایی با پیچیدگی کم را نشان می‌دهند که در طبیعت و در تشکیل میعانات زیست مولکولی بسیار بی‌نظم هستند3،4،5.مطالعات تجربی متعددی ماهیت انعطاف‌پذیر، اغلب بی‌نظم و چند ظرفیتی پروتئین‌هایی را که این میعانات مایع مانند را می‌سازند، نشان داده‌اند، اگرچه اطلاعات کمی در مورد عوامل تعیین‌کننده مولکولی خاص که رشد و بلوغ این میعانات را کنترل می‌کنند به شکل جامدتری در دست داریم. حالت..
داده‌های جدید از این فرضیه پشتیبانی می‌کنند که LLPS ناهنجار مبتنی بر پروتئین و تبدیل قطرات به ساختارهای جامد ممکن است مسیرهای سلولی مرتبطی باشد که منجر به تشکیل توده‌های سمی نامحلول می‌شود که اغلب نشانه‌های بیماری‌های دژنراتیو هستند.بسیاری از پروتئین‌های اختلال ذاتی مرتبط با LLPS (IDP) که اغلب بسیار باردار و انعطاف‌پذیر هستند، مدت‌هاست که از طریق فرآیند تجمع آمیلوئید با تخریب عصبی مرتبط هستند.به طور خاص، میعانات زیست مولکولی IDP مانند FUS7 یا TDP-438 یا پروتئین‌هایی با دامنه‌های بزرگ با پیچیدگی کم مانند hnRNPA19 نشان داده شده است که از طریق فرآیندی به نام سیال شدن، به شکل‌های ژل مانند یا حتی جامد پیر می‌شوند.ترکیب.به انتقال فاز جامد (LSPT) به عنوان تابعی از زمان یا در پاسخ به برخی تغییرات پس از ترجمه یا جهش‌های مهم پاتولوژیک 1،7.
IDP دیگر مرتبط با LLPS in vivo، Tau است، یک پروتئین اختلال مرتبط با میکروتوبول که تجمع آمیلوئید آن در بیماری آلزایمر نقش دارد، اما اخیراً در بیماری پارکینسون (PD) و سایر پروتئینوپاتی‌های هسته‌ای سیناپسی 11، 12، 13 مرتبط است.نشان داده شده است که تاو به دلیل برهمکنش های الکترواستاتیکی مطلوب به طور خود به خود از محلول/سیتوپلاسم جدا می شود که منجر به تشکیل قطرات غنی شده با تاو معروف به کواسروات های الکترواستاتیک می شود.همچنین مشاهده شده است که این نوع برهمکنش غیر اختصاصی، نیروی محرکه بسیاری از میعانات زیست مولکولی در طبیعت است.در مورد پروتئین تاو، تجمع الکترواستاتیکی می‌تواند با تجمع ساده، که در آن نواحی دارای بار مخالف پروتئین، فرآیند برش را آغاز می‌کنند، یا با تجمع پیچیده از طریق تعامل با پلیمرهای دارای بار منفی مانند RNA، تشکیل شود.
اخیراً، α-سینوکلئین (αS)، یک IDP آمیلوئیدی که در PD و سایر بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی که مجموعاً به عنوان synucleinopathy شناخته می‌شوند، در مدل‌های سلولی و حیوانی نشان داده شده است.مطالعات آزمایشگاهی نشان داده‌اند که αS با تجمع ساده از طریق فعل و انفعالات عمدتاً آبگریز تحت LLPS قرار می‌گیرد، اگرچه این فرآیند به غلظت‌های پروتئین فوق‌العاده بالا و زمان‌های انکوباسیون غیر معمول طولانی نیاز دارد.این که آیا میعانات حاوی αS مشاهده شده در داخل بدن توسط این یا سایر فرآیندهای LLPS تشکیل می شوند، یک مسئله کلیدی حل نشده باقی می ماند.به طور مشابه، اگرچه تجمع آمیلوئید αS در نورون‌ها در PD و سایر سینوکلینوپاتی‌ها مشاهده شده است، مکانیسم دقیقی که αS تحت تجمع آمیلوئید درون سلولی قرار می‌گیرد نامشخص است، زیرا به نظر نمی‌رسد بیان بیش از حد این پروتئین به خودی خود این فرآیند را آغاز کند.آسیب سلولی اضافی اغلب مورد نیاز است، که نشان می‌دهد مکان‌های سلولی یا ریزمحیط‌های خاصی برای بازسازی مجدد مجموعه‌های آمیلوئید αS درون سلولی مورد نیاز است.یکی از محیط های سلولی که به ویژه مستعد تجمع است، ممکن است داخل میعانات پروتئینی باشد.
جالب توجه است که αS و tau در ترکیبات بیماری مشخصه در انسان‌های مبتلا به بیماری پارکینسون و سایر سینوکلئینوپاتی‌ها با هم موضعی دارند و آزمایش‌ها یک رابطه پاتولوژیک هم افزایی بین دو پروتئین را گزارش کرده‌اند که نشان می‌دهد یک رابطه بالقوه بین تجمع αS و تاو در بیماری های عصبیبیماری.αS و tau در تعامل و افزایش تجمع یکدیگر در شرایط in vitro و in vivo 28،29 و ترکیبات ناهمگنی متشکل از این دو پروتئین در مغز بیماران مبتلا به سینوکلئینوپاتی مشاهده شده است.با این حال، اطلاعات کمی در مورد اساس مولکولی برهمکنش بین αS و tau و مکانیسم تجمع آن در دست است.گزارش شده است که αS با تاو از طریق یک جاذبه الکترواستاتیکی بین ناحیه C ترمینال با بار منفی بسیار منفی αS و ناحیه مرکزی غنی از پرولین تاو، که در باقیمانده‌های با بار مثبت نیز غنی شده است، تعامل دارد.
در این مطالعه، ما نشان می‌دهیم که αS واقعاً می‌تواند از طریق تراکم کمپلکس الکترواستاتیکی در حضور پروتئین تاو، بر خلاف برهمکنش آن با سایر پلی پپتیدهای دارای بار مثبت مانند پلی-L-لیزین (pLK) به قطرات تجزیه شود و در این فرآیند .αS به عنوان یک مولکول داربست برای شبکه قطرات عمل می کند.ما تفاوت‌های قابل‌توجهی را در فرآیند بلوغ coacervates αS الکترواستاتیک شناسایی کرده‌ایم که با تفاوت در ظرفیت و قدرت تعامل پروتئین‌های درگیر در شبکه coacervate مرتبط است.جالب توجه است، ما تجمع پروتئین‌های آمیلوئید αS و تاو را در کواسروات‌های مایع با عمر طولانی مشاهده کردیم و برخی از عوامل کلیدی را شناسایی کردیم که منجر به تجمع این دو پروتئین در چنین کواسروات‌هایی می‌شود.در اینجا ما این فرآیند را به تفصیل شرح می‌دهیم، که یک مکانیسم مولکولی احتمالی است که زیربنای هم‌نشینی دو پروتئین در اجزای خاص بیماری است.
αS دارای یک دم C ترمینال بسیار آنیونی در pH خنثی است (شکل 1a)، و ما فرض کردیم که می تواند از طریق تراکم کمپلکس های الکترواستاتیک با مولکول های پلی پپتیدی اختلال چند کاتیونی تحت LLPS قرار گیرد.به دلیل ماهیت پلیمری با بار مثبت و نامنظم آن در pH خنثی 32، ما از یک پلی ال-لیزین 100 باقیمانده (pLK) به عنوان مولکول مدل اولیه استفاده کردیم. ابتدا تأیید کردیم که pLK با دامنه Ct αS از طریق طیف‌سنجی Solution NMR تعامل دارد (شکل 1b) با استفاده از αS نشاندار شده با 13C/15N در حضور افزایش نسبت مولی αS:pLK.برهمکنش pLK با حوزه Ct از αS خود را در اختلالات شیفت شیمیایی و کاهش شدت اوج در این ناحیه از پروتئین نشان می‌دهد.جالب اینجاست که وقتی αS را با pLK در غلظت αS تقریباً مخلوط کردیم.5-25 میکرومولار در حضور پلی اتیلن گلیکول (5-15٪ PEG-8) (بافر معمولی LLPS: 10 میلی‌مولار HEPES pH 7.4، 100 میلی‌مولار نمک طعام، 15 درصد PEG-8) بلافاصله میدان وسیعی از تشکیل پروتئین را طی کردیم. .قطرات با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (WF) و میدان روشن (BF) مشاهده شد (شکل 1c).قطرات 1-5 میکرومتری حاوی αS غلیظ (اضافه شده 1 میکرومولار αS، AF488-αS با برچسب AlexaFluor488)، خواص الکترواستاتیکی آنها را می توان از مقاومت آنها در برابر 10٪ 1،6-هگزان دیول (1،6-HD) و حساسیت آن به افزایش غلظت NaCl (شکل 1c).ماهیت سیال مانند کواسروات های کمپلکس الکترواستاتیک αS/pLK با توانایی آنها در همجوشی در عرض میلی ثانیه نشان داده شده است (شکل 1d).با استفاده از کدورت سنجی، تشکیل قطرات را در این شرایط اندازه‌گیری کردیم، ماهیت الکترواستاتیکی برهمکنش اصلی مرتبط با پایداری آن را تأیید کردیم (شکل 1e)، و تأثیر نسبت‌های مختلف پلیمر را بر فرآیند LLPS ارزیابی کردیم (شکل 1f).اگرچه تشکیل قطرات در طیف وسیعی از نسبت‌های پلیمری مشاهده می‌شود، این فرآیند زمانی که pLK بیش از αS باشد بسیار مطلوب است.LLP ها همچنین با استفاده از عامل جابجایی شیمیایی متفاوت دکستران-70 (70 کیلو دالتون) یا با استفاده از انواع فرمت های نمونه، از جمله قطره های اسلاید شیشه ای، چاه های میکروپلیتی از مواد مختلف، مویرگ های اپندورف یا کوارتز مشاهده شده اند.
یک نمایش شماتیک از مناطق مختلف پروتئین در انواع WT-αS و ΔCt-αS مورد استفاده در این مطالعه.دامنه N ترمینال آمفی پاتیک، ناحیه تشکیل دهنده آمیلوئید آبگریز (NAC) و دامنه C ترمینال با بار منفی به ترتیب به رنگ های آبی، نارنجی و قرمز نشان داده شده اند.نقشه خالص شارژ به ازای باقیمانده (NCPR) WT-αS نشان داده شده است.تجزیه و تحلیل NMR برهمکنش αS/pLK در غیاب توده های ماکرومولکولی.با افزایش غلظت pLK (نسبت مولی αS:pLK 1:0.5، 1:1.5 و 1:10 به ترتیب با رنگ سبز روشن، سبز و سبز تیره نشان داده شده است).c αS/pLK (نسبت مولی 1:10) را در 25 میکرومولار (1 میکرومولار αS نشاندار شده با AF488 یا pLK دارای برچسب Atto647N برای تصویربرداری WF) در بافر LLPS (بالا) یا تکمیل شده با 500 میلی مولار NaCl (پایین سمت چپ) یا بعد از 10 کواسروات کنید. % 1،6-هگزان دیول (1،6-HD؛ پایین سمت راست).نوار مقیاس = 20 میکرومتر.d تصاویر میکروسکوپی نمایندگی از همجوشی قطرات BF αS/pLK (نسبت مولی 1:10) در غلظت 25 میکرومولار.فلش ها نشان دهنده ادغام قطره های جداگانه (فلش های قرمز و زرد) در یک قطره جدید (فلش نارنجی) در عرض 200 میلی ثانیه است).نوار مقیاس = 20 میکرومتر.e پراکندگی نور (در 350 نانومتر) تجمع αS/pLK در بافر LLPS قبل و بعد از افزودن 500 میلی مولار NaCl یا 10% 1,6-HD در 25 میکرومولار αS (N = 3 تکرار، میانگین و انحراف استاندارد نیز نشان داده شد).f تصویر BF (بالا) و تجزیه و تحلیل پراکندگی نور (در 350 نانومتر، پایین) تجمع αS/pLK در 25 میکرومولار αS با افزایش نسبت مولی αS:pLK (N = 3 تکرار نمونه، میانگین و انحراف استاندارد نیز نشان داده شد).نوار مقیاس = 10 میکرومتر.نوار مقیاس روی یک تصویر، مقیاس همه تصاویر را در یک پانل نشان می دهد.داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.
بر اساس مشاهدات ما از تراکم کمپلکس الکترواستاتیک αS/pLK و مشاهدات قبلی αS به عنوان یک مولکول مشتری از میعانات tau/RNA از طریق برهمکنش مستقیم با tau31، ما فرض کردیم که αS و tau می‌توانند در غیاب RNA با حلال جدا شوند. متراکم شدناز طریق کمپلکس های الکترواستاتیک، و αS پروتئین داربست در کواسروات های αS/Tau است (به توزیع بار تاو در شکل 2e مراجعه کنید).ما مشاهده کردیم که وقتی 10 میکرومولار αS و 10 میکرومولار Tau441 (به ترتیب حاوی 1 میکرومولار AF488-αS و 1 میکرومولار Atto647N-Tau، به ترتیب) در بافر LLPS با هم مخلوط شدند، آن‌ها به راحتی دانه‌های پروتئینی حاوی هر دو پروتئین را تشکیل دادند، همانطور که توسط میکروسکوپ WF مشاهده می‌شود.(شکل 2 الف).کولوکالیزه شدن دو پروتئین در قطرات توسط میکروسکوپ کانفوکال (CF) تایید شد (شکل تکمیلی 1a).رفتار مشابهی در هنگام استفاده از دکستران-70 به عنوان عامل تجمع مشاهده شد (شکل تکمیلی 1c).با استفاده از PEG یا دکستران با برچسب FITC، متوجه شدیم که هر دو عامل ازدحام کننده به طور مساوی در بین نمونه ها توزیع شده اند و نه جداسازی و نه ارتباط را نشان می دهند (شکل تکمیلی 1d).در عوض، نشان می دهد که در این سیستم آنها جداسازی فاز را از طریق اثرات ازدحام ماکرومولکولی ترویج می کنند، زیرا PEG یک عامل تراکم کننده ترجیحاً پایدار است، همانطور که در سایر سیستم های LLP دیده می شود 33،34.این قطرات غنی از پروتئین نسبت به NaCl (1 M) حساس بودند اما به 1,6-HD (10% v/v) حساس نبودند و خواص الکترواستاتیکی آنها را تایید می‌کرد (شکل تکمیلی 2a, b).رفتار سیال آنها با مشاهده رویدادهای قطرات ادغام میلی ثانیه ای با استفاده از میکروسکوپ BF تایید شد (شکل 2b).
تصاویر میکروسکوپی کانفوکال (CF) از αS/Tau441 coacervates در بافر LLPS (10 میکرومولار از هر پروتئین، 0.5 میکرومولار αS نشاندار شده با AF488 و Tau441 با برچسب Atto647N).ب تصاویر کنتراست تداخل دیفرانسیل (DIC) از رویدادهای همجوشی قطره αS/Tau441 (10 میکرومولار برای هر پروتئین).c نمودار فاز بر اساس پراکندگی نور (در 350 نانومتر) Tau441 LLPS (0-15 میکرومولار) در غیاب (چپ) یا حضور (راست) 50 میکرومولار αS.رنگ های گرم تر نشان دهنده پراکندگی بیشتر است.d پراکندگی نور نمونه های αS/Tau441 LLPS با افزایش غلظت αS (Tau441 در 5 میکرومولار، N = 2-3 تکرار نمونه همانطور که نشان داده شد).e نمایش شماتیک برخی از انواع پروتئین تاو و نواحی مختلف پروتئین مورد استفاده در این مطالعه: دامنه N ترمینال با بار منفی (قرمز)، ناحیه غنی از پرولین (آبی)، دامنه اتصال به میکروتوبول (MTBD، برجسته شده با رنگ نارنجی)، و جفت مارپیچ تشکیل دهنده آمیلوئیدمناطق رشته ای (PHF) واقع در MTBD (خاکستری).نقشه خالص شارژ به ازای باقیمانده (NCPR) Tau441 نشان داده شده است.f با استفاده از αS نشاندار شده با AF488 1 میکرومولار و ΔNt- نشاندار شده با Atto647N، با استفاده از αS یا ΔCt-αS نشاندار شده با AF488 در حضور ΔNt-Tau (بالا، 10 میکرومولار در هر پروتئین) یا K18 (پایین، 50 میکرومولار در هر پروتئین) ) ) ) میکروگراف های WF متراکم شده در بافر LLPS یا K18.نوارهای مقیاس در یک تصویر نشان دهنده مقیاس تمام تصاویر در یک پانل است (20 میکرومتر برای پانل های a، b و f).داده های خام برای پانل های c و d به عنوان فایل های داده خام ارائه می شوند.
برای آزمایش نقش αS در این فرآیند LLPS، ابتدا اثر αS بر ثبات قطرات را با استفاده از نفلومتری با استفاده از افزایش غلظت NaCl بررسی کردیم (شکل 2c).هر چه غلظت نمک در نمونه های حاوی αS بیشتر باشد، مقادیر پراکندگی نور (در 350 نانومتر) بیشتر می شود که نشان دهنده نقش تثبیت کننده αS در این سیستم LLPS است.اثر مشابهی را می توان با افزایش غلظت αS (و در نتیجه نسبت αS:Tau441) به حدود مشاهده کرد.10 برابر افزایش نسبت به غلظت تاو (5 میکرومولار) (شکل 2d).برای نشان دادن اینکه αS یک پروتئین داربست در کواسروات ها است، تصمیم گرفتیم رفتار جهش یافته Tau مختل شده با LLPS را بررسی کنیم، که فاقد یک ناحیه ترمینال N با بار منفی است (باقی مانده های 1-150، به شکل 2e) به نام ΔNt-Tau.میکروسکوپ WF و نفرومتری تأیید کردند که ΔNt-Tau خود تحت LLPS قرار نگرفته است (شکل 2f و شکل تکمیلی 2d)، همانطور که قبلاً گزارش شده است 14. با این حال، هنگامی که αS به محلول های پراکندگی این نوع Tau کوتاه شده اضافه شد، فرآیند LLPS به طور کامل انجام شد. با چگالی قطرات نزدیک به چگالی قطرات محلول‌های با اندازه کامل Tau و αS تحت شرایط و غلظت‌های پروتئین مشابه بازسازی شد.این فرآیند را می توان تحت شرایط ازدحام ماکرومولکولی کم نیز مشاهده کرد (شکل تکمیلی 2c).نقش منطقه αS ترمینال C، اما نه کل طول آن، در فرآیند LLPS با مهار تشکیل قطرات با استفاده از یک نوع αS کوتاه ترمینال C بدون باقیمانده 104-140 (شکل 1a) از (ΔCt-) نشان داده شد. αS) پروتئین (شکل 2f و شکل تکمیلی 2d).کولوکالیزه شدن αS و ΔNt-Tau توسط میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال تایید شد (شکل تکمیلی 1b).
برای آزمایش بیشتر مکانیسم LLPS بین Tau441 و αS، از یک نوع دیگر تاو استفاده شد، یعنی قطعه هسته رشته‌ای مارپیچی جفت شده (PHF) در حوزه اتصال میکروتوبول (MTBD)، که اگر شامل چهار دامنه تکرار مشخصه باشد، معمولاً نیز شناخته می‌شود. به عنوان قطعه K18 (نگاه کنید به شکل 2e).اخیراً گزارش شده است که αS ترجیحاً به یک پروتئین tau واقع در یک دامنه غنی از پرولین در یک توالی که قبل از دامنه اتصال میکروتوبول قرار دارد متصل می شود.با این حال، منطقه PHF همچنین غنی از باقیمانده های با بار مثبت است (شکل 2e را ببینید)، به ویژه لیزین (15٪ باقیمانده)، که ما را بر آن داشت تا آزمایش کنیم که آیا این ناحیه نیز در تراکم کمپلکس αS/Tau نقش دارد یا خیر.ما مشاهده کردیم که K18 به تنهایی نمی تواند LLPS را در غلظت های تا 100 میکرومولار تحت شرایط آزمایش شده (بافر LLPS با 15٪ PEG یا 20٪ دکستران) تحریک کند (شکل 2f).با این حال، هنگامی که 50 میکرومولار αS را به 50 میکرومولار K18 اضافه کردیم، تشکیل سریع قطرات پروتئین حاوی K18 و αS توسط نفرومتری (شکل تکمیلی 2d) و میکروسکوپ WF (شکل 2f) مشاهده شد.همانطور که انتظار می رفت، ΔCt-αS قادر به بازیابی رفتار LLPS K18 نبود (شکل 2f).توجه می‌کنیم که تجمع αS/K18 به غلظت‌های پروتئین کمی بالاتر برای القای LLPS در مقایسه با αS/ΔNt-Tau یا αS/Tau441 نیاز دارد، در حالی که سایر موارد برابر هستند.این با برهمکنش قوی تر ناحیه ترمینال αS C با دامنه Tau غنی از پرولین در مقایسه با دامنه اتصال میکروتوبول، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، مطابقت دارد.
با توجه به اینکه ΔNt-Tau نمی تواند LLPS را در غیاب αS انجام دهد، ما این نوع Tau را به عنوان مدلی برای توصیف αS/Tau LLPS با توجه به سادگی آن در سیستم های LLPS با Tau تمام قد (ایزوتیپ، Tau441/Tau441) انتخاب کردیم.با فرآیندهای تجمع پیچیده (هتروتیپی، αS/Tau441).ما میزان تجمع αS (به عنوان بخشی از پروتئین فاز متراکم، fαS,c) را در سیستم‌های αS/Tau و αS/ΔNt-Tau با سانتریفیوژ و تجزیه و تحلیل SDS-PAGE فاز پراکنده مقایسه کردیم (به 2e مراجعه کنید)، مقادیر بسیار مشابهی یافتیم. برای همه پروتئین ها با غلظت یکسان.به طور خاص، ما fαS,c 84 ± 2٪ و 79 ± 79٪ برای αS/Tau و αS/ΔNt-Tau به ترتیب به دست آوردیم، که نشان می دهد برهمکنش هتروتیپی بین αS و tau نسبت به برهمکنش بین مولکول های تاو برتری دارد.بین.
برهمکنش با پلی‌کاتیون‌های مختلف و تأثیر فرآیند تراکم بر سینتیک αS ابتدا با روش بازیابی فلورسانس پس از سفید کردن نور (FRAP) مورد مطالعه قرار گرفت.ما coacervates αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau و αS/pLK را آزمایش کردیم (100 میکرومولار αS همراه با 2 میکرومولار αS AF488-αS و 100 میکرومولار Tau441 یا ΔNt-Tau یا 1 میلی مولار pLK).داده ها در 30 دقیقه اول پس از اختلاط اجزای نمونه به دست آمد.از تصاویر نماینده FRAP (شکل 3a، تراکم αS/Tau441) و منحنی های مسیر زمانی مربوطه آنها (شکل 3b، شکل تکمیلی 3)، می توان دریافت که سینتیک αS بسیار شبیه به سینتیک های کواسروات Tau441 است.و ΔNt-Tau، که با pLK بسیار سریعتر است.ضرایب انتشار محاسبه شده برای αS در داخل کواسروات مطابق با FRAP (همانطور که توسط کانگ و همکاران 35 توضیح داده شد) 0.009 ± 0.013 μm2 / s D = و 0.008 ± 0.026 μm2 / s D = برای αS/Tau441- و αS / αS است. سیستم αS/.pLK، Tau، و D = 0.18 ± 0.04 µm2/s، به ترتیب (شکل 3c).با این حال، ضریب انتشار αS در فاز پراکنده چندین مرتبه بزرگتر از همه فازهای متراکم است، همانطور که توسط طیف‌سنجی همبستگی فلورسانس (FCS، به شکل تکمیلی 3 مراجعه کنید) در شرایط یکسان (بافر LLPS) اما در غیاب پلی‌کاتیون‌ها تعیین می‌شود. (D = 4 ± 8 µm2/s).بنابراین، سینتیک ترجمه αS به طور قابل توجهی در کواسروات ها در مقایسه با پروتئین های موجود در فاز پراکنده به دلیل اثرات شلوغی مولکولی مشخص کاهش می یابد، اگرچه همه کواسروات ها برخلاف فاز تاو، خواص مایع مانند را در نیم ساعت اول پس از تشکیل خود حفظ می کنند.سینتیک سریعتر در میعانات pLK
تجزیه و تحلیل a-c FRAP دینامیک αS (2٪ αS با برچسب AF488) در کواسروات های الکترواستاتیک.تصاویر نشان‌دهنده سنجش‌های FRAP αS/Tau441 در سه تکرار در (الف) نشان داده شده‌اند، که در آن دایره‌های قرمز نواحی بی‌رنگ را نشان می‌دهند.نوار مقیاس 5 میکرومتر است.b میانگین منحنی‌های FRAP و (c) ضرایب انتشار محاسبه‌شده (D) برای 5-6 (N) قطرات مختلف از سه آزمایش با استفاده از 100 میکرومولار αS و غلظت‌های هم‌مولاری Tau441 (قرمز) یا ΔNt-Tau (آبی) یا pLK (سبز) با غلظت ده برابر LLPS.انحراف استاندارد منحنی FRAP با رنگ سایه دار نشان داده شده است.برای مقایسه، ضریب انتشار αS در فاز پراکنده در سه تکرار با استفاده از طیف‌سنجی همبستگی فلورسانس (FCS) تعیین شد (شکل تکمیلی 3 و روش‌ها را برای اطلاعات بیشتر ببینید).d طیف EPR باند X پیوسته 100 میکرومولار TEMPOL-122-αS در بافر LLPS بدون پلی کاتیون (سیاه) یا در حضور 100 میکرومولار Tau441 (قرمز) یا ΔNt-Tau (آبی) یا 1 میلی مولار pLK (سبز).قسمت داخلی یک نمای بزرگنمایی شده از خطوط میدان قوی را نشان می دهد که در آن چشمگیرترین تغییرات رخ می دهد.e منحنی های اتصال 50 میکرومولار TEMPOL-122-αS با پلی کاتیون های مختلف در غیاب LLPS (بدون PEG).کاهش دامنه باند III در مقایسه با باند II (IIII/III) از طیف نرمال EPR نشان داده شده است که نسبت‌های مولی Tau441 (قرمز)، ΔNt-Tau (آبی) و pLK (سبز) را افزایش می‌دهد.خطوط رنگی با استفاده از یک مدل صحافی خشن با n محل اتصال یکسان و مستقل در هر منحنی، تناسب را با داده ها نشان می دهند.داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.
به عنوان مکمل، ما دینامیک αS را در کواسروات‌های مختلف با استفاده از برچسب‌گذاری اسپین جهت‌دار (SDSL) و رزونانس پارامغناطیس پیوسته الکترون (CW-EPR) بررسی کردیم.این روش ثابت کرده است که در گزارش انعطاف پذیری و پویایی IDP با وضوح واقعی باقیمانده 36،37،38 بسیار مفید است.برای این منظور، ما باقی‌مانده‌های سیستئین را در جهش‌های منفرد Cys ساختیم و از پروب اسپین 4-هیدروکسی-2،2،6،6-تترمتیل پیپریدین-N-oxyl (TEMPOL) استفاده کردیم.مشتقات Maleimide آنها را برچسب گذاری می کنند.به طور خاص، ما پروب های TEMPOL را در موقعیت 122 یا 24 αS (TEMPOL-122-αS و TEMPOL-24-αS) قرار دادیم.در مورد اول، ناحیه C ترمینال پروتئین را هدف قرار می دهیم که در تعامل با پلی کاتیون ها نقش دارد.در عوض، موقعیت 24 می تواند اطلاعاتی در مورد پویایی کلی پروتئین های موجود در میعانات به ما بدهد.در هر دو مورد، سیگنال‌های EPR به‌دست‌آمده برای پروتئین‌های فاز پراکنده با رادیکال‌های نیتروکسید در حالت حرکت سریع مطابقت داشت.پس از جداسازی فاز در حضور tau یا pLK (100 میکرومولار TEMPOL-αS، Tau441 یا ΔNt-Tau در نسبت 1:1 یا pLK در نسبت 1:10)، افزایش در شدت پیک نسبی در طیف EPR αS.خط تلفات گسترده شد، که نشان دهنده کاهش سینتیک جهت گیری مجدد αS در قطرات در مقایسه با پروتئین در فاز رقیق است (شکل 3d، شکل تکمیلی 4a).این تغییرات در موقعیت 122 بارزتر است. در حالی که در موقعیت 24 وجود pLK بر سینتیک کاوشگر تأثیری نداشت، در موقعیت 122 شکل خط طیفی به طور قابل توجهی تغییر کرد (تکمیلی شکل 4a).هنگامی که ما سعی کردیم طیف ها را در موقعیت 122 دو سیستم αS/polycation با استفاده از مدل همسانگرد (شکل تکمیلی 5a) که معمولاً برای توصیف دینامیک IDP38،39 با اسپین نشاندار شده استفاده می شود، مدل کنیم، نتوانستیم طیف های تجربی را بازسازی کنیم..شبیه سازی طیفی موقعیت تضادهای 24 اسپین (شکل تکمیلی 5a).این نشان می دهد که موقعیت های ترجیحی در فضای تنظیمات چرخش ناحیه C ترمینال αS در حضور پلی کاتیون ها وجود دارد.هنگام در نظر گرفتن کسری از αS در فاز متراکم تحت شرایط EPR تجربی (2±84٪، 7±79٪ و 47±4٪ برای αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau، و αS/pLK، به ترتیب - به مکمل مراجعه کنید. شکل 2e از تجزیه و تحلیل داده ها ج)، می توان مشاهده کرد که گسترش تشخیص داده شده توسط روش EPR عمدتاً منعکس کننده تعامل ناحیه C ترمینال αS با پلی کاتیون های مختلف در فاز متراکم است (تغییر اصلی هنگام استفاده از TEMPOL-122-). αS)، و نه تراکم پروتئین.افزایش میکرو ویسکوزیته در پروب مشاهده می شود.همانطور که انتظار می رفت، طیف EPR پروتئین تحت شرایطی غیر از LLPS زمانی که 1 مولار NaCl به مخلوط اضافه شد، به طور کامل بازیابی شد (شکل تکمیلی 4b).به طور کلی، داده‌های ما نشان می‌دهد که تغییرات شناسایی‌شده توسط CW-EPR عمدتاً منعکس‌کننده تعامل ناحیه C ترمینال αS با پلی‌کاتیون‌های مختلف در فاز متراکم است، و به نظر می‌رسد این تعامل با pLK قوی‌تر از Tau باشد.
به منظور به دست آوردن اطلاعات ساختاری بیشتر در مورد پروتئین های موجود در کواسروات، تصمیم گرفتیم سیستم LLPS را با استفاده از NMR در محلول مطالعه کنیم.با این حال، ما فقط توانستیم کسر αS باقی مانده در فاز پراکنده را تشخیص دهیم، که ممکن است به دلیل کاهش دینامیک پروتئین در داخل کواسروات و یک فاز متراکم در انتهای محلول در تجزیه و تحلیل NMR باشد.هنگامی که ساختار و دینامیک پروتئین باقی مانده در فاز پراکنده نمونه LLPS را با استفاده از NMR تجزیه و تحلیل کردیم (شکل تکمیلی 5c, d)، متوجه شدیم که پروتئین در حضور pLK و ΔNt-Tau، هر دو، تقریباً یکسان رفتار می کند. که در ساختار ثانویه و پویایی ستون فقرات پروتئین بودند، که توسط آزمایش‌ها بر روی شیفت شیمیایی ثانویه و آرامش R1ρ آشکار شد.داده‌های NMR نشان می‌دهد که C-پایانه αS به دلیل برهم‌کنش با پلی‌کاتیون‌ها، در حالی که طبیعت بی‌نظم خود را حفظ می‌کند، انعطاف‌پذیری ساختاری را از دست می‌دهد.
از آنجایی که گسترش سیگنال CW-EPR مشاهده شده در فاز متراکم TEMPOL-122-αS منعکس کننده تعامل پروتئین با پلی کاتیون ها است، ما یک تیتراسیون EPR برای ارزیابی میل اتصال αS به پلی کاتیون های مختلف در غیاب LLPS (بدون تجمع LLPS) انجام دادیم. بافر LLPS)، نشان می‌دهد که فعل و انفعالات در فازهای رقیق و غلیظ یکسان هستند (که توسط داده‌های ما، شکل تکمیلی 4a و شکل تکمیلی 6 تایید می‌شود).هدف این بود که ببینیم آیا همه کواسروات‌ها، علی‌رغم ویژگی‌های رایج سیال‌مانندشان، رفتار متفاوتی در سطح مولکولی از خود نشان می‌دهند یا خیر.همانطور که انتظار می رفت، طیف EPR با افزایش غلظت پلی کاتیون گسترش یافت و منعکس کننده کاهش انعطاف پذیری مولکولی به دلیل برهم کنش های مولکولی همه شرکای تعامل تقریباً تا حد اشباع بود (شکل 3e، شکل تکمیلی 6).pLK این اشباع را در یک نسبت مولی کمتر (Polycation: αS) در مقایسه با ΔNt-Tau و Tau441 به دست آورد.در واقع، مقایسه داده ها با یک مدل اتصال تقریبی با فرض n محل اتصال یکسان و مستقل نشان داد که ثابت تفکیک ظاهری pLK (~ 5 میکرومولار) یک مرتبه قدر کمتر از Tau441 یا ΔNt-Tau (~50 میکرومولار) است. ).میکرومولار).اگرچه این یک تخمین تقریبی است، اما این نشان می‌دهد که αS تمایل بیشتری برای پلی‌کاتیون‌های ساده‌تر با نواحی بار مثبت پیوسته دارد.با توجه به این تفاوت در تمایل بین αS و پلی کاتیون های مختلف، ما فرض کردیم که خواص مایع آنها ممکن است در طول زمان متفاوت باشد و بنابراین از فرآیندهای LSPT مختلف رنج می برند.
با توجه به محیط بسیار شلوغ درون کواسروات پروتئینی و ماهیت آمیلوئیدی پروتئین، ما رفتار کواسروات را در طول زمان برای تشخیص فرآیندهای احتمالی LSPT مشاهده کردیم.با استفاده از میکروسکوپ BF و CF (شکل 4)، مشاهده کردیم که αS/Tau441 تا حد زیادی در محلول به هم متصل می‌شود و قطرات بزرگی را تشکیل می‌دهد که همانطور که انتظار می‌رفت، سطح پایین چاه/لغزش را به صورت قطرات کامل در تماس و خیس می‌کنند (شکل تکمیلی). 7d)؛ما به این ساختارهای با شکل پایین "کلک های پروتئینی" می گوییم.این ساختارها چون توانایی ذوب شدن را حفظ کردند (شکل 7b تکمیلی) سیال باقی ماندند و تا چند ساعت پس از شروع LLPS قابل مشاهده بودند (شکل 4 و شکل تکمیلی 7c).ما مشاهده کردیم که همانطور که برای کواسروات های الکترواستاتیکی با بارهای نامتعادل و در نتیجه پتانسیل های سطح الکترواستاتیک بالا انتظار می رود، فرآیند خیس کردن بر روی سطح مواد آبدوست به جای مواد آبگریز مورد علاقه است (تکمیلی شکل 7a).قابل توجه، ادغام αS/ΔNt-Tau و رفتینگ به طور قابل توجهی کاهش یافت، در حالی که میعانات αS/pLK به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 4).در طول زمان انکوباسیون کوتاه، قطرات αS/pLK قادر به ادغام و خیس شدن سطح آب دوست بودند، اما این فرآیند به سرعت متوقف شد و پس از 5 ساعت انکوباسیون، تنها رویدادهای ادغام محدودی مشاهده نشد.- انتقال ژل به قطره
نماینده BF (پانل‌های مقیاس خاکستری) و CF (پانل‌های سمت راست، αS با برچسب AF488 به رنگ سبز) نمونه‌های کواسروات حاوی 100 µM αS (برچسب فلورسنت 1٪) در بافر LLPS در حضور 100 µM Tau441 (تصاویر فلورسانس بالا) ΔNt -Tau (مرکز) یا 1 میلی‌مولار pLK (پایین) در زمان‌های جوجه‌کشی و ارتفاع‌های کانونی مختلف (z، فاصله از پایین صفحه چاه).آزمایش ها 4-6 بار مستقل از یکدیگر با نتایج یکسان تکرار شد.کواسروات های αS/Tau441 بعد از 24 ساعت خیس می شوند و قایق هایی بزرگتر از تصویر تشکیل می دهند.نوار مقیاس برای همه تصاویر 20 میکرومتر است.
سپس ما پرسیدیم که آیا استخرهای بزرگ پروتئین مایع مانند تشکیل شده در αS/Tau441 LLPS منجر به تجمع آمیلوئید هر یک از پروتئین های مورد مطالعه می شود یا خیر.ما بلوغ قطرات αS/Tau441 را در طول زمان با میکروسکوپ WF تحت شرایط مشابه بالا دنبال کردیم، اما با استفاده از αS نشاندار شده با AF488 1 میکرومولار و Tau441 با برچسب Atto647N (شکل 5a).همانطور که انتظار می رفت، ما محلی سازی کامل پروتئین را در طول فرآیند بلوغ مشاهده کردیم.جالب است که از حدود.پس از 5 ساعت، ساختارهای غیر دایره ای شدیدتری در داخل قایق ها مشاهده شد که ما آنها را "نقاط" نامیدیم، که برخی از آنها با αS و برخی در Tau441 غنی شده بودند (شکل 5a، فلش های سفید).این نقاط همیشه در داخل قایق ها به میزان بیشتری برای αS/ΔNt-Tau نسبت به αS/ΔNt-Tau مشاهده شده است.هیچ نقطه مشخصی در قطرات سیستم‌های pLK و Tau که برای همجوشی/خیساندن ناتوان نبودند وجود نداشت.برای آزمایش اینکه آیا این لکه‌های حاوی αS و Tau441 دانه‌های آمیلوئیدی هستند، آزمایش مشابهی را با استفاده از میکروسکوپ CF انجام دادیم که در آن Tau441 با Atto647N برچسب‌گذاری شد و 12.5 میکرومولار تیوفلاوین-T (ThT) مخصوص آمیلوئید از همان ابتدا اضافه شد.رنگاگرچه رنگ آمیزی ThT قطرات یا قایق های αS/Tau441 حتی پس از 24 ساعت جوجه کشی مشاهده نشد (شکل 5b، قطرات ردیف بالا - باقیمانده قطرات روی قایق های پروتئینی)، ساختارهای ThT مثبت حاوی Atto647N-Tau441 در داخل قایق ها بسیار ضعیف بودند.این اندازه، شکل، و محل لکه‌های توصیف‌شده قبلی را تکرار می‌کند (شکل 5b، ردیف‌های میانی و پایینی)، که نشان می‌دهد این لکه‌ها ممکن است با دانه‌های آمیلوئیدی تشکیل شده در کواسروات‌های مایع پیری مطابقت داشته باشند.
WF 25 میکرومولار αS در زمان‌های جوجه‌کشی و ارتفاعات کانونی مختلف (z، فاصله از پایین محدود نشده) در حضور 25 میکرومولار Tau441 (1 میکرومولار αS با برچسب AF488 و Tau441 با برچسب Atto647N) در یک چاه صفحه میکروسکوپی با بافر LLPS) .شش آزمایش به طور مستقل با نتایج مشابه تکرار شد.b تصویر میکروسکوپی CF از 25 میکرومولار αS در حضور 25 میکرومولار Tau441 (1 میکرومولار Tau441 با Atto647N نشاندار شده) و 12.5 میکرومولار تیوفلاوین-T (ThT).قطرات وزنی پروتئین و قایق‌ها و لکه‌های پروتئین رسوب‌شده به ترتیب در ردیف‌های بالا و میانی نشان داده شده‌اند.ردیف پایین تصاویری از قایق ها و قطره ها از 3 تکرار مستقل را نشان می دهد.فلش های سفید نقطه های ThT مثبت را در هر دو پانل نشان می دهد.نوار مقیاس برای همه تصاویر 20 میکرومتر است.
برای بررسی جزئیات بیشتر تغییرات در شبکه پروتئین کواسروات در طول انتقال از مایع به جامد، از تصویربرداری طول عمر فلورسانس (FLIM) و میکروسکوپ انتقال انرژی تشدید فورستر (FRET) استفاده کردیم (شکل 6 و شکل های تکمیلی 8 و 9).ما فرض کردیم که بلوغ کواسروات لایه به یک ساختار پروتئینی متراکم‌تر یا حتی جامد مانند منجر به تماس نزدیک‌تر بین پروتئین و پروب فلورسنت متصل به آن می‌شود و به طور بالقوه باعث ایجاد یک اثر خاموش‌کننده می‌شود که در طول عمر پروب کوتاه‌تر (τ) آشکار می‌شود. همانطور که قبلا توضیح داده شد40.,41,42.علاوه بر این، برای نمونه‌های دارای برچسب دوبل (AF488 و Atto647N به‌ترتیب به عنوان رنگ‌های دهنده و گیرنده FRET)، این کاهش در τ می‌تواند با تراکم coacervate و افزایش راندمان FRET (E) در طول LSPT همراه باشد.ما تشکیل قایق و لکه را در طول زمان در نمونه‌های LLPS αS/Tau441 و αS/ΔNt-Tau (25 میکرومولار از هر پروتئین در بافر LLPS حاوی 1 میکرومولار AF488 برچسب‌دار αS و/یا Atto647N با برچسب Tau441 یا ΔNt-Tau) نظارت کردیم.ما یک روند کلی را مشاهده کردیم که طول عمر فلورسانس پروب های AF488 (τ488) و Atto647N (τ647N) اندکی با بلوغ کواسروات ها کاهش یافت (شکل 6 و شکل تکمیلی 8c).جالب توجه است، این تغییر به طور قابل توجهی برای نقاط درون قایق ها افزایش یافته است (شکل 6c)، که نشان می دهد تراکم پروتئین بیشتر در نقاط رخ داده است.در تأیید این موضوع، هیچ تغییر قابل توجهی در طول عمر فلورسانس برای قطرات αS/ΔNt-Tau با سن 24 ساعت مشاهده نشد (تصویر تکمیلی 8d)، که نشان می دهد ژل شدن قطرات فرآیندی متمایز از لکه بینی است و با سازماندهی مجدد مولکولی قابل توجهی همراه نیست. درون کواسروات هالازم به ذکر است که نقاط دارای اندازه های مختلف و محتوای متغیر در αS هستند، به خصوص برای سیستم αS/Tau441 (تکمیلی شکل 8e).کاهش طول عمر فلورسانس نقطه ای با افزایش شدت، به ویژه برای Tau441 با برچسب Atto647N (تصویر تکمیلی 8a) و راندمان FRET بالاتر برای هر دو سیستم αS/Tau441 و αS/ΔNt-Tau همراه بود، که نشان دهنده تراکم بیشتر در پنج ساعت LLPS است. پس از تحریک، پروتئین های داخل الکتریسیته ساکن متراکم شدند.در مقایسه با αS/ΔNt-Tau، ما مقادیر τ647N کمتر و تا حدودی بالاتر τ488 را در نقاط αS/Tau441 مشاهده کردیم که با مقادیر FRET کمتر و ناهمگن همراه بود.احتمالاً، این ممکن است به این واقعیت مرتبط باشد که در سیستم αS/Tau441، فراوانی αS مشاهده شده و مورد انتظار در سنگدانه ها ناهمگن تر است، اغلب در مقایسه با Tau، زیر استوکیومتری است، زیرا Tau441 خود نیز ممکن است تحت LLPS و تجمع قرار گیرد (شکل تکمیلی 8e). .با این حال، درجه ادغام قطرات، تشکیل قایق، و مهمتر از همه، تجمع پروتئین در coacervates مایع مانند حداکثر است زمانی که هر دو Tau441 و αS وجود دارد.
تصاویر میکروسکوپ فلورسانس مادام العمر (FLIM) αS/Tau441 و αS/ΔNt-Tau در 25 میکرومولار از هر پروتئین (1 میکرومولار αS نشاندار شده با AF488 و 1 میکرومولار Tau441 با برچسب Atto647N یا ΔNt-Tau) در بافر LLPS.ستون ها تصاویر نماینده نمونه های LLPS را در زمان های مختلف بلوغ (30 دقیقه، 5 ساعت و 24 ساعت) نشان می دهند.قاب قرمز ناحیه حاوی لکه های αS/Tau441 را نشان می دهد.طول عمر به صورت نوارهای رنگی نشان داده می شود.نوار مقیاس = 20 میکرومتر برای همه تصاویر.b تصویر FLIM بزرگنمایی شده از ناحیه انتخاب شده، که در کادر قرمز در پانل a نشان داده شده است.محدوده عمر با استفاده از مقیاس رنگ مشابه در پانل a نشان داده شده است.نوار مقیاس = 5 میکرومتر.c هیستوگرام‌هایی که AF488 (متصل به αS) یا Atto647N (متصل به Tau) را برای گونه‌های مختلف پروتئین (قطرات-D-، raft-R- و speckle-P) نشان می‌دهند که در تصاویر FLIM ثبت‌شده برای αS-) طول عمر توزیع‌های زمان‌بندی Tau441 و نمونه های coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI برای D، 29-44 ROI برای R، و 21-51 ROI برای نقاط).مقادیر میانگین و میانه به ترتیب به صورت مربع های زرد و خطوط سیاه در داخل جعبه ها نشان داده می شوند.کران های پایین و بالایی جعبه به ترتیب نشان دهنده ی ربع های اول و سوم هستند و حداقل و حداکثر مقادیر در محدوده بین چارکی 1.5 برابری (IQR) به صورت سبیل نشان داده شده اند.نقاط پرت به صورت الماس سیاه نشان داده می شوند.اهمیت آماری بین جفت توزیع ها با استفاده از آزمون t دو نمونه ای با فرض واریانس های نابرابر تعیین شد.مقادیر p آزمون t دو دنباله با ستاره برای هر جفت داده مقایسه شده نشان داده شده است (* p-value > 0.01، ** p-value > 0.001، *** p-value > 0.0001، **** p-value > 0.00001)، ns نشان دهنده ناچیز بودن است (p-value > 0.05).مقادیر دقیق p در جدول تکمیلی 1 آورده شده است و داده های اصلی به صورت فایل های داده خام ارائه شده اند.
برای نشان دادن بیشتر ماهیت آمیلوئیدی لکه‌ها/دانه‌ها، نمونه‌های کواسروات رنگ‌آمیزی را به مدت 24 ساعت با غلظت‌های بالای (1 مولار) NaCl تحت درمان قرار دادیم که منجر به جداسازی سنگدانه‌ها از کواسروات‌های پروتئینی شد.هنگامی که سنگدانه های جدا شده (یعنی محلول پراکنده از سنگدانه ها) با استفاده از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) مشاهده شد، ما یک مورفولوژی عمدتا کروی با ارتفاع منظم حدود 15 نانومتر مشاهده کردیم که تمایل دارد تحت شرایط غلظت نمک بالا، مشابه رفتار فیبریل های آمیلوئید معمولی به دلیل اثر آبگریز قوی بر روی سطح (توجه داشته باشید که فیبرها معمولاً دارای ارتفاع ~ 10 نانومتر هستند) (تکملی شکل 10a).جالب توجه است، هنگامی که سنگدانه های جدا شده با ThT در یک سنجش فلورسانس استاندارد ThT انکوبه شدند، ما افزایش چشمگیری را در بازده کوانتومی فلورسانس ThT مشاهده کردیم، که قابل مقایسه با زمانی است که رنگ با فیبریل های آمیلوئید αS معمولی انکوبه شد (شکل تکمیلی 10). سنگدانه های کواسروات حاوی ساختارهای آمیلوئید مانند هستند..در واقع، سنگدانه‌ها به غلظت‌های نمک بالا متحمل بودند، اما به 4 مولار گوانیدین کلرید (GdnHCl)، مانند فیبریل‌های آمیلوئید معمولی حساس بودند (شکل تکمیلی 10c).
سپس، ترکیب دانه‌ها را با استفاده از فلورسانس تک مولکولی، طیف‌سنجی همبستگی/همبستگی متقابل فلورسانس خاص (FCS/FCCS) و تجزیه و تحلیل انفجاری تشخیص تصادف دو رنگ (TCCD) تجزیه و تحلیل کردیم.برای این منظور، ما سنگدانه‌هایی را جدا کردیم که پس از 24 ساعت انکوباسیون در 100 میکرولیتر نمونه‌های LLPS حاوی αS و Tau441 (هر دو 25 میکرومولار) به همراه 1 میکرومولار αS برچسب‌دار با AF488 و 1 میکرومولار با برچسب Atto647N Tau441 تشکیل شدند.محلول دانه پراکنده حاصل را با استفاده از همان بافر بدون PEG و 1 مولار NaCl (همان بافری که برای جداسازی سنگدانه ها از کواسروات استفاده می شود) به حالت تک مولکولی رقیق کنید تا از هرگونه برهمکنش احتمالی الکترواستاتیکی بین LLPS و پروتئین جلوگیری شود.نمونه ای از مسیر زمانی یک مولکول منفرد را می توان در شکل 7a مشاهده کرد.تجزیه و تحلیل FCCS/FCS (همبستگی متقابل، CC و خودهمبستگی، AC) نشان داد که سنگدانه های حاوی αS و tau در نمونه ها فراوان بودند (به منحنی CC در شکل 7b، پانل سمت چپ مراجعه کنید)، و مقدار اضافی پروتئین مونومر باقیمانده به عنوان یک نتیجه فرآیند رقیق سازی (به منحنی های AC در شکل 7b، پانل سمت چپ مراجعه کنید).آزمایش‌های کنترلی که تحت شرایط محلول یکسان با استفاده از نمونه‌هایی که فقط حاوی پروتئین‌های مونومر بودند، هیچ منحنی CC را نشان ندادند، و منحنی‌های AC به خوبی با مدل انتشار یک جزئی (معادل 4) مطابقت دارند، جایی که پروتئین‌های مونومر دارای ضرایب انتشار مورد انتظار هستند (شکل 7b). )، پانل سمت راست).ضریب انتشار ذرات انباشته شده کمتر از 1 میکرومتر مربع بر ثانیه و پروتئین های مونومر حدود 1 میکرومتر مربع بر ثانیه است.50-100 میکرومتر بر ثانیه؛مقادیر مشابه مقادیر منتشر شده قبلی برای فیبریل های آمیلوئید αS و αS مونومر به طور جداگانه تحت شرایط محلول مشابه است.هنگامی که ما سنگدانه ها را با تجزیه و تحلیل انفجار TCCD تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 7c، پانل بالا)، متوجه شدیم که در هر سنگدانه جدا شده (هتروآگرگات αS/Tau)، حدود 60٪ از سنگدانه های شناسایی شده حاوی αS و tau هستند، حدود 30٪ فقط شامل تاو، فقط 10% αS.تجزیه و تحلیل استوکیومتری هتروآگرگیت‌های αS/Tau نشان داد که بیشتر هتروآگرگات‌ها در تاو غنی شده‌اند (استوکیومتری زیر 0.5، میانگین تعداد مولکول‌های تاو در هر سنگدانه 4 برابر بیشتر از مولکول‌های αS است)، که با کار ما که در FLIM در محل مشاهده شد مطابقت دارد. آزمایش..تجزیه و تحلیل FRET نشان داد که این سنگدانه ها حاوی هر دو پروتئین هستند، اگرچه مقادیر واقعی FRET در این مورد اهمیت زیادی ندارند، زیرا توزیع فلوروفورها در هر دانه به دلیل بیش از حد پروتئین بدون برچسب مورد استفاده در آزمایش تصادفی بود.جالب توجه است، هنگامی که ما همان تجزیه و تحلیل را با استفاده از نوع تاو دارای کمبود تجمع آمیلوئید بالغ 45،46 انجام دادیم (به شکل تکمیلی 11a,b مراجعه کنید)، متوجه شدیم که اگرچه تجمع الکترواستاتیک αS یکسان بود (تکمیلی شکل 11c, d). توانایی تشکیل دانه‌ها در کواسروات به شدت کاهش یافت و FLIM چندین نقطه را در آزمایش‌های درجا شناسایی کرد، و منحنی‌های همبستگی ضعیف برای نمونه‌های مجزای جدا شده مشاهده شد.با این حال، برای تعداد کمی از دانه‌های شناسایی‌شده (فقط یک دهم Tau441)، مشاهده کردیم که هر یک از دانه‌ها در αS نسبت به این نوع Tau غنی شده بود، با تقریباً 50٪ از دانه‌های شناسایی‌شده فقط حاوی مولکول‌های αS بودند، و αS بیش از حد ناهمگن بود. .سنگدانه ها (به شکل تکمیلی 11e مراجعه کنید)، بر خلاف سنگدانه های ناهمگن تولید شده توسط Tau441 (شکل 6f).نتایج این آزمایش‌ها نشان داد که اگرچه αS خود قادر به تجمع با تاو در داخل کواسروات است، هسته‌زایی تاو در این شرایط مطلوب‌تر است و دانه‌های آمیلوئید مانند حاصل می‌توانند به عنوان شکلی از αS و تاو عمل کنند.با این حال، هنگامی که یک هسته غنی از تاو تشکیل می شود، برهمکنش های هتروتیپی بین αS و تاو در دانه ها نسبت به برهمکنش های هموتایپی بین مولکول های تاو ترجیح داده می شود.ما همچنین شبکه های پروتئینی را در coacervates αS/tau مایع مشاهده می کنیم.
فلورسانس نماینده ردهای زمانی از مولکول های منفرد از سنگدانه های جدا شده در αS/Tau441 coacervates الکترواستاتیک تشکیل شده است.انفجارهای مربوط به انعقادهای αS/Tau441 (ترکدهای بالاتر از آستانه نشان داده شده) در سه کانال تشخیص (انتشار AF488 و Atto647N پس از تحریک مستقیم، خطوط آبی و قرمز، انتشار Atto647N پس از تحریک غیر مستقیم)، FRET، خط بنفش مشاهده شد.b تجزیه و تحلیل FCS/FCCS نمونه ای از دانه های αS/Tau441 جدا شده به دست آمده از LLPS (پانل سمت چپ).منحنی های خودهمبستگی (AC) برای AF488 و Atto647N به ترتیب به رنگ آبی و قرمز و منحنی های همبستگی متقابل (CC) مرتبط با سنگدانه های حاوی هر دو رنگ به رنگ بنفش نشان داده شده اند.منحنی‌های AC منعکس‌کننده حضور گونه‌های پروتئینی مونومری و انباشته شده هستند، در حالی که منحنی‌های CC فقط انتشار دانه‌های دارای برچسب دوگانه را نشان می‌دهند.همان تجزیه و تحلیل، اما تحت شرایط محلول مشابه در نقاط جدا شده، نمونه‌های حاوی تنها αS مونومر و Tau441 به عنوان کنترل در پانل سمت راست نشان داده می‌شوند.c تجزیه و تحلیل فلش فلورسانس تک مولکول های دانه های جدا شده در coacervates الکترواستاتیک αS/Tau441 تشکیل شده است.اطلاعات مربوط به هر مجموعه ای که در چهار تکرار مختلف یافت می شود (N = 152) در برابر استوکیومتری، مقادیر S و کارایی FRET آنها رسم می شود (پانل بالا، نوار رنگی نشان دهنده وقوع است).سه نوع سنگدانه را می توان متمایز کرد: دانه های فقط -αS با S~1 و FRET~0، سنگدانه های فقط Tau با S~0 و FRET~1، و سنگدانه های Tau/αS ناهمگن با S و FRET متوسط ​​تخمین های مقدار. از هر دو پروتئین نشانگر شناسایی شده در هر مجموعه ناهمگن (N = 100) در پانل پایین نشان داده شده است (مقیاس رنگ منعکس کننده وقوع است).داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.
بلوغ یا پیری میعانات پروتئین مایع به ساختارهای ژل مانند یا جامد در طول زمان گزارش شده است که در چندین عملکرد فیزیولوژیکی میعانات47 و همچنین در بیماری نقش دارد، به عنوان یک فرآیند غیر طبیعی قبل از تجمع آمیلوئید 7، 48، 49. در اینجا ما جدایی فاز و رفتار را با جزئیات مطالعه می کنیم.LSPT αS در حضور پلی کاتیون‌های تصادفی در یک محیط کنترل‌شده در غلظت‌های میکرومولاری پایین و شرایط فیزیولوژیکی مرتبط (توجه داشته باشید که غلظت فیزیولوژیکی محاسبه‌شده αS > 1 µM50 است)، به دنبال رفتار ترمودینامیکی معمول LPS.ما دریافتیم که αS، که حاوی یک منطقه C ترمینال با بار منفی بالا در pH فیزیولوژیکی است، قادر است قطرات غنی از پروتئین را در محلول آبی از طریق LLPS در حضور پپتیدهای بسیار کاتیونی اختلال مانند pLK یا Tau از طریق فرآیند الکترواستاتیک تشکیل دهد. تراکم پیچیده در حضور ماکرومولکول های تجمعی.این فرآیند ممکن است اثرات مرتبطی در محیط سلولی داشته باشد، جایی که αS با مولکول‌های پلی کاتیونی مختلف مرتبط با تجمع مرتبط با بیماری خود در شرایط in vitro و in vivo مواجه می‌شود.
در بسیاری از مطالعات، دینامیک پروتئین در قطرات به عنوان یکی از عوامل کلیدی تعیین کننده فرآیند بلوغ در نظر گرفته شده است.در کواسروات های αS الکترواستاتیک با پلی کاتیون ها، فرآیند بلوغ ظاهراً به قدرت برهمکنش با پلی کاتیون ها، ظرفیت و تعدد این برهمکنش ها بستگی دارد.تئوری تعادل پیشنهاد می کند که چشم انداز تعادلی از دو حالت مایع وجود یک قطره بزرگ غنی از پلیمرهای زیستی است که LLPS57,58 را به حرکت در می آورد.رشد قطرات را می توان با بلوغ استوالد59، ادغام60 یا مصرف مونومر آزاد در فاز پراکنده به دست آورد.برای αS و Tau441، ΔNt-Tau یا pLK، بیشتر پروتئین در میعانات تحت شرایط مورد استفاده در این مطالعه متمرکز شد.با این حال، در حالی که قطرات تاو در اندازه کامل به سرعت در هنگام خیس شدن سطح به هم می پیوندند، ادغام قطرات و خیس شدن برای ΔNt-Tau و pLK دشوار بود، که نشان دهنده از دست دادن سریع خواص مایع در این دو سیستم است.با توجه به تجزیه و تحلیل FLIM-FRET ما، قطرات قدیمی pLK و ΔNt-Tau درجه مشابهی از تجمع پروتئین (طول عمر فلورسانس مشابه) را مانند قطرات اصلی نشان دادند، که نشان می دهد شبکه پروتئین اصلی حفظ شده است، البته سفت تر.
ما نتایج تجربی خود را در مدل زیر منطقی می کنیم (شکل 8).قطرات اولیه تشکیل شده به طور موقت اغلب شبکه های پروتئینی بدون جبران الکترواستاتیکی هستند، و بنابراین مناطقی از عدم تعادل بار، به خصوص در فصل مشترک قطرات، وجود دارد که منجر به قطرات با پتانسیل سطح الکترواستاتیک بالا می شود.برای جبران بار (پدیده ای که معمولاً به آن کاهش ظرفیت گفته می شود) و به حداقل رساندن پتانسیل سطحی قطرات، قطرات می توانند شامل پلی پپتیدهای جدید از فاز رقیق شوند، شبکه های پروتئینی را مجددا سازماندهی کنند تا تعاملات بار-بار را بهینه کنند، و با سایر قطرات تعامل داشته باشند.با سطوح (خیساندن).قطرات αS/pLK، به دلیل شبکه پروتئینی ساده‌ترشان (فقط برهمکنش‌های هتروتیپی بین αS و pLK) و تمایل بیشتر برای برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین، به نظر می‌رسد که می‌توانند بار میعانات را سریع‌تر متعادل کنند.در واقع، ما سینتیک پروتئین سریع‌تر را در coacervates αS / pLK در ابتدا نسبت به αS / Tau مشاهده کردیم.پس از کاهش ظرفیت، فعل و انفعالات کمتر زودگذر می شوند و قطرات خاصیت مایع خود را از دست می دهند و به قطرات ژل مانند و غیر قابل اشتعال با پتانسیل سطح الکترواستاتیک پایین تبدیل می شوند (و بنابراین قادر به خیس کردن سطح نیستند).در مقابل، قطرات αS/Tau در بهینه‌سازی تعادل بار قطرات به دلیل شبکه‌های پروتئینی پیچیده‌تر (هم با برهمکنش‌های هموتایپی و هتروتیپی) و ماهیت ضعیف‌تر برهمکنش‌های پروتئین کارآمدتر هستند.این منجر به قطراتی می شود که رفتار مایع را برای مدت زمان طولانی حفظ می کنند و پتانسیل سطح الکترواستاتیک بالایی را نشان می دهند که تمایل دارد با ادغام و رشد به حداقل برسد (در نتیجه نسبت سطح به حجم قطرات به حداقل می رسد) و با خیس کردن مواد شیمیایی سطح آبدوست.این باعث ایجاد کتابخانه‌های پروتئین متمرکز بزرگی می‌شود که خواص سیال را حفظ می‌کنند زیرا فعل و انفعالات به دلیل جستجوی مداوم برای بهینه‌سازی شارژ در شبکه پروتئین بسیار گذرا باقی می‌مانند.جالب توجه است که اشکال بریده‌شده در انتهای N تاو، از جمله برخی ایزوفرم‌های طبیعی ۶۲، رفتار متوسطی از خود نشان می‌دهند، با برخی از کواسروات‌ها با αS پیر می‌شوند و به قطرات ژل‌مانند با عمر طولانی تبدیل می‌شوند، در حالی که برخی دیگر به میعانات مایع بزرگ تبدیل می‌شوند.این دوگانگی در بلوغ کواسروات های الکترواستاتیک αS با مطالعات نظری و تجربی اخیر LLPS که ارتباط بین کاهش ظرفیت و الک الکترواستاتیکی در میعانات را به عنوان کلیدی برای کنترل اندازه میعانات و خواص سیال شناسایی کرده اند، مطابقت دارد.مکانیسم 58.61.
این طرح مسیر تجمع آمیلوئید فرضی را برای αS و Tau441 از طریق LLPS و LSPT نشان می‌دهد.با نواحی اضافی غنی از آنیون (قرمز) و غنی از کاتیون (آبی)، کواسروات‌های الکترواستاتیک αS و تاو با ظرفیت رضایت‌بخش انرژی سطحی پایین‌تری دارند و در نتیجه ادغام کمتری دارند و در نتیجه پیری قطرات سریع می‌شوند.حالت ژل غیر آگلومره پایدار به دست می آید..این وضعیت در مورد سیستم αS/pLK به دلیل میل ترکیبی بالاتر و شبکه تعامل پروتئین-جفت ساده‌تر آن، که امکان انتقال سریع ژل مانند را فراهم می‌کند، بسیار مطلوب است.برعکس، قطرات با ظرفیت نامناسب و در نتیجه، نواحی دارای بار پروتئینی موجود برای برهمکنش، ترکیب شدن و خیس شدن سطح آبدوست را برای کواسروات آسان‌تر می‌کنند تا انرژی سطح بالای آن کاهش یابد.این وضعیت برای coacervates αS/Tau441، که دارای یک شبکه پیچیده چند ظرفیتی متشکل از برهمکنش‌های ضعیف Tau-Tau و αS-Tau هستند، ترجیح داده می‌شود.به نوبه خود، کواسروات های بزرگتر به راحتی خواص مایع مانند خود را حفظ می کنند و به سایر فعل و انفعالات پروتئین به پروتئین امکان می دهند.در نهایت، توده‌های ناهمگن آمیلوئید حاوی αS و tau در داخل مایع coacervate تشکیل می‌شوند، که ممکن است مربوط به آن‌هایی باشد که در بدن‌های انکلوژن یافت می‌شوند، که از علائم بیماری‌های نورودژنراتیو هستند.
ساختارهای سیال مانند بزرگی که در طول بلوغ αS/Tau441 با محیط پروتئینی بسیار پرتراکم اما پویا و تا حدی کمتر، coacervates αS/ΔNt-Tau تشکیل شده اند، مخازن ایده آل برای هسته زایی تجمع پروتئین هستند.ما در واقع تشکیل توده‌های پروتئین جامد را در این نوع کواسروات‌های پروتئینی مشاهده کرده‌ایم که اغلب حاوی αS و tau هستند.ما نشان داده‌ایم که این هتروآگرگات‌ها توسط فعل و انفعالات غیرالکترواستاتیکی تثبیت می‌شوند، می‌توانند رنگ‌های ThT مخصوص آمیلوئید را به همان روشی که فیبریل‌های آمیلوئید معمولی متصل می‌کنند، و در واقع مقاومت مشابهی در برابر تأثیرات مختلف دارند.دانه‌های αS/tau که توسط LLPS تشکیل شده‌اند، خواصی شبیه آمیلوئید دارند.در واقع، نوع بالغ Tau کمبود تجمع آمیلوئیدی به طور قابل‌توجهی در تشکیل این دانه‌های αS ناهمگن در کواسروات الکترواستاتیک مایع مختل می‌شود.تشکیل دانه‌های αS/Tau441 تنها در داخل کواسروات‌ها مشاهده شد که خواص مایع مانند را حفظ می‌کردند، و هرگز، اگر coacervates / قطرات به حالت ژل نرسیدند.در حالت دوم، افزایش قدرت برهمکنش‌های الکترواستاتیک و در نتیجه، صلبیت شبکه پروتئینی از بازآرایی‌های ساختاری لازم پروتئین‌ها برای ایجاد برهمکنش‌های پروتئینی جدید لازم برای هسته‌زایی آمیلوئید جلوگیری می‌کند.با این حال، این را می توان در کواسروات های انعطاف پذیرتر و مایع مانند به دست آورد، که به نوبه خود با افزایش اندازه، احتمال بیشتری دارد که مایع باقی بمانند.
این واقعیت که تشکیل سنگدانه ها در فاز متراکم در میعانات بزرگ αS/Tau نسبت به قطرات کوچکی که به سرعت ژل می شوند ترجیح داده می شود، ارتباط شناسایی عوامل کنترل کننده ادغام قطرات را برجسته می کند.بنابراین، نه تنها تمایل به جداسازی فاز وجود دارد، بلکه اندازه میعانات باید برای عملکرد مناسب و همچنین پیشگیری از بیماری کنترل شود.نتایج ما همچنین اهمیت تعادل بین LLPS و LSPT را برای سیستم αS/Tau برجسته می‌کند.در حالی که تشکیل قطرات ممکن است با کاهش مقدار مونومرهای پروتئینی موجود در شرایط اشباع در برابر تجمع آمیلوئید محافظت کند، همانطور که در سیستم‌های دیگر پیشنهاد شده است، ادغام قطرات در سطوح قطرات بالا ممکن است به تجمع پروتئین داخلی از طریق بازآرایی‌های ساختاری کند منجر شود.شبکه های پروتئینی.
به طور کلی، داده‌های ما به شدت بر ارتباط ظرفیت منسجم و تعاملات راضی/ناراضی در شبکه‌های دراپ در زمینه LSPT تأکید می‌کنند.به طور خاص، ما نشان می‌دهیم که میعانات با طول کامل αS/Tau441 می‌توانند به طور موثر با هم ترکیب شده و هسته‌ای شوند تا هتروآگرگات‌های آمیلوئید مانندی را تشکیل دهند که هر دو پروتئین را شامل می‌شوند و یک مکانیسم مولکولی را بر اساس نتایج تجربی ما پیشنهاد می‌کنند.تجمع دو پروتئین در کواسروات مایع αS/Tau که در اینجا گزارش می‌کنیم ممکن است در واقع مربوط به هم‌محلی‌سازی دو پروتئین در آخال‌ها باشد که نشانه‌های بیماری هستند و ممکن است به درک رابطه بین LLPS و تجمع آمیلوئید، راه را برای IDP پر بار در تخریب عصبی هموار می کند.
انواع مونومر WT-αS، جهش سیستئین (Q24C-αS، N122C-αS) و انواع ΔCt-αS (Δ101-140) در E. coli بیان و همانطور که قبلاً توضیح داده شد خالص شدند.5 میلی‌مولار DTT در تمام مراحل خالص‌سازی موتانت‌های سیستئین αS برای جلوگیری از تشکیل پیوند دی سولفیدی گنجانده شد.ایزوفرم Tau441 (پلاسمید به‌دست‌آمده از Addgene #16316)، واریانت ΔNt-Tau (Δ1-150، به‌دست‌آمده از شبیه‌سازی IVA با آغازگرهای CTTTAAGAAGGAGAGATACATATGATCGCCCACACCGCGG، CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC، CATATGTATATCCTCTTCTTAAAAGTTAAAC،57DACTCTCTCTTCTTAAAGTAAAF1،5Aggant-purified،Δ1-AggAGTAAAF1،5-Aggant. پرایمر) کشت E. coli بود به OD600 = 0.6-0.7 در 37 درجه سانتی گراد و 180 دور در دقیقه رشد کرد و بیان با IPTG به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد القا شد.سلول ها را در 11500 xg به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد برداشت کنید و با بافر سالین حاوی 150 میلی مولار NaCl شستشو دهید.گلوله را مجدداً در بافر لیز معلق کنید (20 میلی‌لیتر در هر لیتر LB: MES 20 میلی‌مولار، pH 6.8، NaCl 500 میلی‌مولار، EDTA 1 میلی‌مولار، MgCl2 0.2 میلی‌مولار، DTT 5 میلی‌مولار، PMSF 1 میلی‌مولار، بنزامیدین 50 میکرومولار در میکرومولار، کوپ).مرحله سونیکاسیون روی یخ با دامنه 80 درصد برای 10 پالس (1 دقیقه روشن، 1 دقیقه خاموش) انجام شد.در یک سونوگرافی از 60 میلی لیتر تجاوز نکنید.لیزهای E. coli به مدت 20 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند، سپس روی یخ سرد شدند و به مدت 40 دقیقه در 127000×g سانتریفیوژ شدند.مایع رویی شفاف شده روی یک غشای 3.5 کیلو دالتون (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific، UK) اعمال شد و در برابر 4 لیتر بافر دیالیز (20 میلی‌مولار MES، pH 6.8، NaCl 50 میلی‌مولار، EDTA 1 میلی‌مولار، MgCl2 2 میلی‌مولار، DTT دیالیز شد. ، PMSF 0.1 میلی مولار) به مدت 10 ساعت.یک ستون تبادل کاتیونی 5 میلی‌لیتری (HiTrap SPFF، Cytiva، MA، ایالات متحده آمریکا) با بافر تعادل (20 میلی‌مولار MES، pH 6.8، 50 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار EDTA، 2 میلی‌مولار MgCl2، 2 میلی‌مولار DTT، 0.1 میلی‌مولار PMSF) متعادل شد.لیزات تاو از طریق فیلتر 0.22 میکرومتر PVDF فیلتر شد و با سرعت جریان 1 میلی لیتر در دقیقه به ستون تزریق شد.شستشو به تدریج انجام شد، تاو با 15-30٪ بافر شستشو (20 میلی‌مولار MES، pH 6.8، 1 مولار NaCl، 1 میلی‌مولار EDTA، 2 میلی‌مولار MgCl2، 2 میلی‌مولار DTT، 0.1 میلی‌مولار PMSF) شسته شد.فراکسیون ها توسط SDS-PAGE آنالیز شدند و هر فراکسیون حاوی یک باند با وزن مولکولی مورد انتظار تاو با استفاده از فیلتر سانتریفیوژ 10 کیلو دالتون غلیظ شد و با یک بافر حاوی 10 میلی مولار HEPES، pH 7.4، NaCl 500 میلی‌مولار و DTT 2 میلی‌مولار جایگزین شد. غلظت پروتئین نهایی 100 میکرومولار بود.سپس محلول پروتئین از فیلتر 0.22 میکرومتر PVDF عبور داده شد، به سرعت منجمد شد و در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد.پروتئین K18 با مهربانی توسط پروفسور آلبرتو بوفی ارائه شد.خلوص آماده سازی بیش از 95٪ بود که توسط SDS-PAGE و MALDI-TOF/TOF تأیید شد.سیستئین های مختلف از نظر شیمیایی با AlexaFluor488-maleimide (AF488، ThermoFisher Scientific، Waltham، MA، USA) یا TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals، تورنتو، کانادا) برچسب گذاری شدند.توسط جذب و MALDI-TOF/TOF تایید شدند.Tau441، ΔNt-Tau، AggDef-Tau و K18 با باقیمانده های سیستئین بومی در موقعیت های 191 و 322 با استفاده از Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH، Siegen، آلمان) به دنبال همان روش برچسب گذاری شدند.نقشه های شارژ خالص به ازای هر باقیمانده برای αS و Tau441 با استفاده از CIDER66 ایجاد شد.
پلی ال-لیزین جامد (pLK DP 90-110 طبق NMR از تامین کننده، Alamanda Polymers Inc، هانتسویل، آلاباما، ایالات متحده آمریکا) در 10 میلی مولار HEPES، 100 میلی مولار NaCl، pH 7.4 تا 10 میلی مولار غلظت حل شد، فرآیند سونیکاسیون به مدت 5 دقیقه در حمام آب اولتراسونیک و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.PEG-8، dextran-70، FITC-PEG-10 (Biochempeg، Watertown، MA، USA) و FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich، Sant Louis، MI، USA) محلول در آب هستند و به طور گسترده در بافر LLPS توزیع می شوند.دیالیز نمک های آلوده را حذف می کند.سپس آنها از طریق یک فیلتر سرنگ با اندازه منافذ 0.22 میکرومتر فیلتر شدند و غلظت آنها با استفاده از یک انکسارسنج (Mettler Toledo، کلمبوس، اوهایو، ایالات متحده آمریکا) محاسبه شد.نمونه‌های LLPS در دمای اتاق به ترتیب زیر تهیه شدند: بافر و اکستروژن مخلوط شدند و 1 میلی‌مولار تریس (2-کربوکسی اتیل) فسفین (TCEP، Carbosynth، Compton، UK)، 1 میلی‌مولار 2،2،2،2- (اتان- 1، 2-diyldinitrile) تترااستیک اسید (EDTA، کربوکسینث) و مخلوطی از 1٪ مهارکننده پروتئاز (PMSF 100 میلی‌مولار، بنزیمید 1 میلی‌مولار، لوپپتین 5 میکرومولار).سپس αS و پلی کاتیون های ذوب شده (گزینه های pLK یا Tau) اضافه می شوند.برای آزمایش‌های سری زمانی تیوفلاوین-T (ThT، Carbosynth، Compton، UK)، از غلظت کل ThT برای نصف غلظت αS استفاده کنید.نمونه ها را به آرامی اما به طور کامل مخلوط کنید تا مطمئن شوید که همگن هستند.غلظت هر جزء از آزمایشی به آزمایش دیگر متفاوت بود، همانطور که در بخش نتایج توضیح داده شد.هر زمان که طول مدت آزمایش از 4 ساعت بیشتر شد، از آزید در غلظت 02/0 درصد (وزنی/حجمی) استفاده شد.برای تمام آنالیزهایی که از نمونه های LLPS استفاده می کنند، اجازه دهید مخلوط به مدت 5 دقیقه قبل از آنالیز متعادل شود.برای تجزیه و تحلیل پراکندگی نور، 150 میکرولیتر از نمونه ها بر روی میکروپلیت های 96 چاهی غیر اتصال دهنده (μClear®، مشکی، F-Bottom/Chimney Well، Greiner bio-one، Kremsmünster، اتریش) بارگذاری شد و با فیلم چسب پوشانده شد.LLP ها با اندازه گیری جذب در 350 نانومتر در مرکز محلول در صفحه خوان CLARIOstar (BMG Labtech، Ortenberg، آلمان) تحت نظارت قرار گرفتند.آزمایش ها در دمای 25 درجه سانتی گراد در سه تکرار انجام شد و خطاها به عنوان انحراف استاندارد از میانگین محاسبه شد.فاز رقیق با سانتریفیوژ نمونه و آنالیز ژل SDS-PAGE اندازه‌گیری شد و کسر αS در فازهای رقیق و غلیظ در محلول‌های مختلف LLPS اندازه‌گیری شد.یک نمونه LLPS 100 میکرولیتری حاوی αS با برچسب AF488 با 1 میکرومولار با اختلاط کامل و سپس سانتریفیوژ در 9600 × گرم به مدت 30 دقیقه تهیه شد و پس از آن رسوب معمولاً قابل مشاهده بود.50 میکرولیتر بالای مایع رویی برای تعیین کمیت پروتئین با استفاده از ژل SDS-PAGE استفاده شد.ژل ها با فیلترهای AF488 با استفاده از سیستم تصویربرداری ژل ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) اسکن شدند یا با رنگ کوماسی رنگ آمیزی شدند و با فیلترهای مناسب مشاهده شدند.نوارهای حاصل با استفاده از ImageJ نسخه 1.53i (موسسه ملی بهداشت، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شدند.آزمایش ها به صورت تکراری در دو آزمایش مختلف با نتایج مشابه انجام شد.
به طور معمول، 150 میکرولیتر از نمونه ها روی میکروپلیت های 96 چاهی غیر اتصال دهنده اعمال شد و در دمای اتاق روی میکروسکوپ معکوس Leica DMI6000B (Leica Microsystems، Wetzlar، آلمان) مشاهده شد.برای آزمایش‌های نقطه‌ای، صفحات رگ‌زایی μ-اسلاید (Ibidi GmbH، Gräfelfing، آلمان) یا میکروپلیت‌های پلی استایرن 96 چاهی (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) نیز استفاده شدند.لامپ های هالوژن EL6000 یا متال هالید جیوه به عنوان منابع روشنایی (به ترتیب برای تصویربرداری BF/DIC و WF) استفاده شد.برای میکروسکوپ WF، یک هدف هوا با بزرگنمایی 40 برابر (Leica Microsystems، آلمان) برای متمرکز کردن نور بر روی نمونه و جمع‌آوری آن استفاده شد.برای نمونه‌های دارای برچسب AF488 و ThT، تحریک و انتشار فیلتر با مجموعه‌های فیلتر استاندارد GFP، فیلترهای باند گذر تحریک و انتشار به ترتیب، فیلترهای باند گذر 460-500 و 512-542 نانومتر، و یک آینه دو رنگی 495 نانومتر.برای نمونه های برچسب گذاری شده با Atto647N، مجموعه ای استاندارد از فیلترهای Cy5 با فیلترهای باند گذر تحریک و انتشار به ترتیب 628-40 نانومتر و 692-40 نانومتر و یک آینه دو رنگی 660 نانومتر استفاده شد.برای میکروسکوپ BF و DIC، از همان هدف جمع آوری نور منعکس شده استفاده کنید.نور جمع‌آوری‌شده بر روی یک دوربین CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems، آلمان) ثبت شد.زمان نوردهی 50 میلی ثانیه برای تصویربرداری میکروسکوپ BF و DIC و 20-100 میلی ثانیه برای تصویربرداری میکروسکوپ WF بود.برای مقایسه، زمان قرار گرفتن در معرض برای همه آزمایش‌ها با ThT 100 میلی‌ثانیه بود.آزمایش‌های تایم لپس برای تجسم ادغام قطرات انجام شد و تصاویر هر 100 میلی‌ثانیه برای چند دقیقه جمع‌آوری شدند.ImageJ (NIH، ایالات متحده آمریکا) برای تجزیه و تحلیل تصویر استفاده شد.آزمایش ها در سه تکرار با نتایج مشابه انجام شد.
برای آزمایش‌های colocalization، FRAP و بازسازی سه‌بعدی، تصاویر بر روی یک میکروسکوپ کانفوکال معکوس زایس LSM 880 با استفاده از نسخه آبی ZEN 2 (Carl Zeiss AG، Oberkochen، آلمان) به‌دست آمد.نمونه‌های 50 میکرولیتری بر روی ظروف پتری μ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH، Gröfelfing، آلمان)، تیمار شده با یک پلیمر آبدوست (ibiTreat) و در یک هدف غوطه‌وری 63× روغن (روغن Plan-Apochromat 63×/NA 1.4) استفاده شد. در DIC).تصاویر با استفاده از خطوط لیزر آرگون 458 نانومتر، 488 نانومتر و 633 نانومتر با وضوح 0.26 میکرومتر بر پیکسل و زمان نوردهی 8 میکرومتر بر پیکسل برای پنجره‌های تشخیص تحریک و انتشار 470-600 نانومتر، 493-628 نانومتر به دست آمد. و 638-755 نانومتر به ترتیب برای تجسم ThT، AF488 و Atto647N استفاده شد.برای آزمایش‌های FRAP، عکاسی با گذشت زمان از هر نمونه با سرعت 1 فریم در ثانیه ثبت شد.آزمایش ها در سه تکرار در دمای اتاق با نتایج مشابه انجام شد.تمامی تصاویر با استفاده از نرم افزار Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) آنالیز شدند.منحنی‌های FRAP نرمال‌سازی شدند، رسم شدند و به داده‌های شدت/زمان استخراج‌شده از تصاویر با استفاده از Zen 2 با استفاده از OriginPro 9.1 برازش شدند.منحنی‌های بازیابی به یک مدل تک نمایی برای در نظر گرفتن انتشار مولکولی با یک عبارت نمایی اضافی برای توضیح اثر سفیدکننده اکتسابی برازش داده شدند.سپس D را با استفاده از شعاع سفید کننده اسمی و نیمه عمر بازیابی تعیین شده قبلی همانطور که در معادله کانگ و همکارانش در نظر گرفته شده است، محاسبه کردیم.5 35 نشان داده شده است.
انواع سیستئین منفرد αS با 4-هیدروکسی-2،2،6،6-تترا متیل پیپریدین-N-اکسیل (TEMPOL) در موقعیت های 24 (TEMPOL-24-αS) و 122 (TEMPOL-122-αS) سنتز شدند. به ترتیب.نشان‌گذاری چرخش برای آزمایش‌های EPR، غلظت αS روی 100 میکرومولار تنظیم شد و غلظت PEG 15٪ (w/v) بود.برای شرایط مختلف تجمع، نسبت αS: pLK 1:10 بود، در حالی که نسبت αS: ΔNt-Tau و αS: Tau441 در 1: 1 حفظ شد.برای آزمایش‌های تیتراسیون اتصال در غیاب ازدحام، TEMPOL-122-αS در 50 میکرومولار حفظ شد و پلی‌کاتیون‌ها در غلظت‌های افزایشی تیتر شدند و هر شرایط را به‌طور جداگانه آماده کردند.اندازه‌گیری‌های CW-EPR با استفاده از یک طیف‌سنج باند X Bruker ELEXSYS E580 مجهز به تشدیدگر Bruker ER4118 SPT-N1 که در فرکانس مایکروویو (SHF) ~9.7 گیگاهرتز کار می‌کند، انجام شد.دما روی 25 درجه سانتیگراد تنظیم شد و توسط کرایوستات نیتروژن مایع کنترل شد.طیف‌ها تحت شرایط غیراشباع با توان مگاوات 4 میلی‌وات، دامنه مدولاسیون 0.1 mT و فرکانس مدولاسیون 100 کیلوهرتز به‌دست آمدند.شدت طیفی برای جلوگیری از تفاوت در غلظت اسپین بین نمونه‌ها و کاهش احتمالی اسپین به دلیل غلظت باقیمانده عوامل کاهنده در نمونه‌های حاوی Tau441 یا ΔNt-Tau (در محلول‌های پروتئین اصلی) نرمال شد.مقادیر داده شده g در نتیجه مدلسازی طیفی EPR با استفاده از نرم افزار Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) پیاده سازی شده در Matlab®67 به دست آمد.برای مدل سازی داده ها از مدل های همسانگرد یک یا دو جزء استفاده شد.پس از نرمال سازی تمام سیگنال ها، باقیمانده ها با کم کردن هر شبیه سازی از طیف تجربی مربوطه محاسبه شدند.برای تجزیه و تحلیل تیتراسیون اتصال، شدت نسبی باند سوم به باند دوم از طیف EPR نرمال شده (IIII/III) برای نظارت بر اتصال پلی‌کاتیون‌ها به αS استفاده شد.برای تخمین ثابت تفکیک (Kd)، منحنی حاصل به یک مدل تقریبی با فرض n محل اتصال یکسان و مستقل برازش داده شد.
آزمایش‌های طیف‌سنجی NMR با استفاده از یک طیف‌سنج NMR 800 مگاهرتز Bruker Neo (1H) مجهز به کرایوپروب و گرادیان Z انجام شد.تمام آزمایش‌ها با استفاده از 130-207 µM αS و معادل‌های αS/ΔNt-Tau و pLK مربوطه در 10 میلی‌مولار HEPES، 100 میلی‌مولار NaCl، 10 درصد DO، pH 7.4 انجام شد و در دمای 15 درجه سانتی‌گراد انجام شد.برای نظارت بر LPS توسط NMR، 10% PEG به نمونه های از پیش مخلوط شده اضافه شد.نمودار اغتشاش شیفت شیمیایی (شکل 1b) میانگین تغییرات شیمیایی 1H و 15N را نشان می دهد.طیف αS 2D1H-15N HSQC بر اساس تخصیص قبلی (ورودی BMRB #25227) اختصاص داده شد و با ضبط و تجزیه و تحلیل طیف‌های سه بعدی HNCA، HNCO و CBCAcoNH تأیید شد.شیفت های شیمیایی 13Cα و 13Cβ در حضور ΔNt-Tau یا pLK برای اندازه گیری تغییرات احتمالی در روند ساختار ثانویه در مقایسه با تغییرات شیمیایی αS در ترکیب سیم پیچ تصادفی خالص 68 محاسبه شد (شکل تکمیلی 5c).نرخ R1ρ با ضبط آزمایش‌های hsqctretf3gpsi (به‌دست‌آمده از کتابخانه بروکر) با تأخیرهای 8، 36، 76، 100، 156، 250، 400 و 800 میلی‌ثانیه اندازه‌گیری شد و توابع نمایی با اوج تأخیر در پیک‌های مختلف تنظیم شدند. بار برای تعیین R1ρ و عدم قطعیت تجربی آن.
آزمایش‌های میکروسکوپ فلورسانس با زمان تفکیک‌شده دو رنگ بر روی یک میکروسکوپ کانفوکال فلورسانس MT200 با زمان تفکیک‌شده تجاری (PicoQuant، برلین، آلمان) با دستگاه شمارش فوتون منفرد مرتبط با زمان (TCSPC) انجام شد.سر دیود لیزری برای تحریک پالسی در هم لایه (PIE) استفاده می شود، پرتو از یک موجبر تک حالته عبور می کند و با توان لیزر 10 تا 100 نانووات برای خطوط لیزر 481 نانومتر و 637 نانومتر که پس از یک آینه دو رنگ اندازه گیری می شود، تنظیم می شود.این امر سرعت شمارش فوتون بهینه را تضمین می‌کند و از اثرات نامطلوب شدن فوتون، سفید کردن نور و اشباع جلوگیری می‌کند.صفحات یا صفحات پوششی رگ زایی μ-اسلاید (Ibidi GmbH، Gräfelfing، آلمان) مستقیماً در آب غوطه ور روی یک لنز Super Apochromat 60x NA 1.2 با یقه اصلاحی (Olympus Life Sciences، Waltham، USA) قرار گرفتند.یک آینه دو رنگی 488/640 نانومتر (Semrock، Lake Forest، IL، USA) به عنوان تقسیم کننده پرتو اصلی استفاده شد.تشعشعات غیرمتمرکز توسط سوراخی به قطر 50 میکرون مسدود می شود، سپس تابش متمرکز توسط یک تقسیم کننده پرتو 50/50 به 2 مسیر تشخیص تقسیم می شود.فیلترهای انتشار باند (Semrock، Lake Forest، IL، USA) 520/35 برای رنگ سبز (AF488) و 690/70 برای رنگ قرمز (Atto647N) در جلوی آشکارساز استفاده شد.دیودهای بهمن تک فوتونی (SPAD) (دستگاه های میکرو فوتون، بولزانو، ایتالیا) به عنوان آشکارساز استفاده شدند.هر دو جمع آوری و تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار تجاری موجود SymphoTime64 (PicoQuant GmbH، برلین، آلمان) انجام شد.
پنجاه میکرولیتر از نمونه های LLPS به چاه های رگزایی μ-اسلاید (Ibidi GmbH، Gräfelfing، آلمان) استفاده شد.تصاویر به‌دست‌آمده تا 20 میکرومتر بالای کف چاه برای فاصله کاری بهینه برای قطرات معلق و تا 1 میکرومتر برای قایق‌ها و نقاط با وضوح محوری حداقل 0.25 میکرومتر بر پیکسل و زمان تاخیر 400 میکرومتر بر پیکسل متمرکز می‌شوند.داده‌ها را با اعمال آستانه شدت بر اساس شدت سیگنال پس‌زمینه متوسط ​​(PBG، میانگین + 2σ) برای هر کانال انتخاب کنید تا فقط قطرات، قایق‌ها یا نقاط پروتئین مایع انتخاب شوند و هرگونه منشأ احتمالی از فاز پراکنده را فیلتر کنید.برای تجزیه و تحلیل طول عمر هر گونه (τ) از هر کانال (سبز، "g" برای AF488 و قرمز، "r" برای Atto647N)، مناطق مورد علاقه (ROIs) حاوی قطرات، قایق ها یا لکه ها را انتخاب کردیم (شکل تکمیلی 1). ).8b) و آنها را با تطبیق پوسیدگی طول عمر آنها (τD، τR و τP برای قطرات، قایق ها یا لکه ها، به ترتیب، به شکل تکمیلی 8c مراجعه کنید) در هر کانال با استفاده از تجزیه و تحلیل دم فیت و یک مدل پوسیدگی دو جزیی، استخراج کرد.میانگین τ از τ .ROI هایی که فوتون های بسیار کمی برای تناسب چند نمایی تولید می کردند، از تجزیه و تحلیل حذف شدند.برش استفاده شده <104 فوتون برای رافت و نقطه و 103 برای قطره بود.قطرات آستانه پایین‌تری دارند زیرا به‌دست آوردن منحنی‌های فروپاشی با مقادیر شدت بالاتر دشوار است، زیرا قطرات در میدان تصویر معمولاً کوچک‌تر و کم‌تر هستند.ROI با تعداد فوتون بالاتر از حد تجمع فوتون (تنظیم شده روی 500 شمارش/پیکسل) نیز برای تجزیه و تحلیل دور انداخته شد.منحنی فروپاشی شدت به‌دست‌آمده از ناحیه مورد نظر را با شدت 90 درصد حداکثر (کمی پس از حداکثر شدت پوسیدگی) از ابتدای عمر مفید مطابقت دهید تا از حداقل تداخل IRF اطمینان حاصل کنید و در عین حال برای تمام شدت‌های فروپاشی یکسان باقی بماند. تنظیمات پنجره زمان نسبی 25 تا 50 ROI برای رافت ها و نقاط و 15-25 ROI برای قطره ها، تصاویر از بیش از 4 تکرار ثبت شده از حداقل 3 آزمایش مستقل انتخاب شدند.آزمون t دو طرفه برای ارزیابی تفاوت های آماری بین گونه ها یا بین سیستم های coacervate استفاده شده است.برای تجزیه و تحلیل پیکسل به پیکسل طول عمر (τ)، میرایی کل طول عمر بیش از میدان برای هر کانال محاسبه شد و تقریبی از یک مدل تضعیف نمایی 2/3 جزء انجام شد.تضعیف طول عمر برای هر پیکسل سپس با استفاده از مقادیر τ محاسبه‌شده قبلی برازش داده شد، که منجر به یک تصویر مناسب FLIM شبه رنگ شد.محدوده طول عمر tail-fit در تمام تصاویر یک کانال یکسان بود و هر فروپاشی فوتون های کافی برای ارائه یک تناسب قابل اعتماد تولید می کرد.برای تجزیه و تحلیل FRET، پیکسل ها با اعمال آستانه شدت پایین تر از 100 فوتون، که میانگین سیگنال پس زمینه (FBG) 11 فوتون را نشان می دهد، انتخاب شدند.شدت فلورسانس هر کانال توسط فاکتورهای تصحیح آزمایشی تعیین شده تصحیح شد: 69 تداخل طیفی α 0.004، β تحریک مستقیم 0.0305، بازده تشخیص γ 0.517 بود.سپس بازده FRET در سطح پیکسل با استفاده از معادله زیر محاسبه می شود:
که در آن FDD شدت فلورسانس مشاهده شده در کانال دهنده (سبز)، FDA شدت فلورسانس مشاهده شده در کانال گیرنده (قرمز) تحت تحریک غیرمستقیم، و FAA شدت فلورسانس مشاهده شده در کانال گیرنده (قرمز) تحت تحریک مستقیم است. پای).پالس های شدت فلورسانس در کانال مشاهده می شود).
100 میکرولیتر از محلول های واکنش LLPS حاوی 25 میکرومولار مونومر Tau441 بدون برچسب (با یا بدون 25 میکرومولار αS) را در بافر LLPS (مکمل مانند بالا) روی میکروپلیت های 96 چاهی غیر اتصال دهنده با پوشش فویل چسب قرار دهید و تشکیل قطرات پس از میکروسکوپ WF بررسی شد. تعادلدر عرض 10 دقیقهپس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق، وجود رافت ها و لکه های پروتئینی تایید شد.سپس مایع را با دقت از روی قایق ها از چاه ها خارج کنید، سپس 50 لیتر بافر تفکیک (10 میلی مولار HEPES، pH 7.4، 1 مولار NaCl، 1 میلی مولار DTT) اضافه کنید و به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید.غلظت بالای نمک تضمین می‌کند که LLPS به دلیل باقی‌مانده PEG تکرار نمی‌شود و مجموعه‌های پروتئینی احتمالی که فقط در اثر فعل و انفعالات الکترواستاتیکی تشکیل شده‌اند از هم جدا می‌شوند.سپس کف چاه با نوک میکروپیپت به دقت خراش داده شد و محلول حاصل به یک چاه مشاهده خالی منتقل شد.پس از انکوباسیون نمونه ها با 50 میکرومولار ThT به مدت 1 ساعت، وجود لکه های جدا شده با میکروسکوپ WF بررسی شد.فیبرهای αS سونیک شده را با انکوبه کردن 300 میکرولیتر از محلول αS 70 میکرومولار در PBS با pH 7.4، سدیم آزید 0.01٪ در دمای 37 درجه سانتی گراد و 200 دور در دقیقه روی یک تکان دهنده اوربیتال به مدت 7 روز آماده کنید.سپس محلول در 9600×g به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد، گلوله مجدداً در PBS pH 7.4 معلق شد و نمونه های فیبریل (1 دقیقه، سیکل 50٪، دامنه 80٪ در دستگاه سونیکاتور Vibra-Cell VC130، Sonics، Newton، USA) فراصوت شد. با توزیع اندازه نسبتا یکنواخت فیبرهای کوچک.
تجزیه و تحلیل FCS/FCCS و تشخیص تصادف دو رنگ (TCCD) بر روی همان میکروسکوپ کانفوکال فلورسنت MT200 (Pico-Quant، برلین، آلمان) مورد استفاده برای آزمایش‌های میکروسکوپ FLIM-FRET با استفاده از حالت PIE انجام شد.توان لیزر برای این آزمایش ها به 6.0 میکرووات (481 نانومتر) و 6.2 میکرووات (637 نانومتر) اضافه شد.ترکیبی از این قدرت‌های لیزر برای تولید روشنایی مشابه برای جفت‌های فلوروفور مورد استفاده در حین دستیابی به نرخ‌های شمارش بهینه و اجتناب از سفید کردن نور و اشباع انتخاب شد.هر دو جمع آوری و تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار تجاری موجود SymphoTime64 نسخه 2.3 (PicoQuant، برلین، آلمان) انجام شد.
نمونه‌های سنگدانه‌های αS/Tau جدا شده به‌دست‌آمده با استفاده از LLPS در بافر جداسازی تا غلظت تک مولکولی مناسب رقیق می‌شوند (معمولاً رقت 1:500، زیرا وقتی که از نمونه‌های کواسروات جدا می‌شوند، سنگدانه‌ها در غلظت‌های پایین هستند).نمونه‌ها مستقیماً روی ورقه‌های پوششی (کورنینگ، ایالات متحده آمریکا) که با محلول BSA با غلظت 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر پوشش داده شده بودند، اعمال شدند.
برای تجزیه و تحلیل PIE-smFRET در کانال های سبز و قرمز، آستانه شدت پایین 25 فوتون برای فیلتر کردن سیگنال های با شدت کم ناشی از رویدادهای مونومر اعمال شد (توجه داشته باشید که تعداد مونومرها از نمونه های انباشته در مقایسه با سنگدانه های جدا شده بیشتر است).این آستانه به عنوان پنج برابر شدت متوسط ​​αS مونومر به دست آمده از تجزیه و تحلیل نمونه های مونومر خالص به منظور انتخاب خاص دانه ها برای تجزیه و تحلیل محاسبه شد.مدار درایو PIE، همراه با اکتساب داده TSCPC، استفاده از یک فیلتر وزنی مادام العمر را فعال کرده است که به حذف پس زمینه و تداخل طیفی کمک می کند.شدت شعله ور شدن انتخاب شده با استفاده از آستانه های بالا با استفاده از میانگین سیگنال پس زمینه تعیین شده از هیستوگرام های وقوع در مقابل شدت/بین نمونه های فقط بافر تصحیح شد.انفجارهای مرتبط با سنگدانه های بزرگ معمولاً چندین سطل متوالی را در ردیابی زمانی (تنظیم شده بر روی 1 میلی ثانیه) اشغال می کنند.در این موارد، سطل با حداکثر استحکام انتخاب شد.برای تجزیه و تحلیل FRET و استوکیومتری، از فاکتور گاما γ (517/0) به صورت نظری تعیین شده استفاده شد.تداخل طیفی و سهم تحریک مستقیم در توان لیزر تحریک استفاده شده ناچیز است (به صورت تجربی تعیین می شود).بازده و استوکیومتری FRET در یک انفجار به صورت زیر محاسبه می شود.