310 10*1 میلی متر لوله های مارپیچ فولادی ضد زنگ جزء شیمیایی، حوزه های N ترمینال اسپیدروین هیدروژل هایی را بر اساس فیبرهای آمیلوئید تشکیل می دهند و بستری را برای تثبیت پروتئین فراهم می کنند.

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.شما از یک نسخه مرورگر با پشتیبانی محدود CSS استفاده می کنید.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نشان می‌دهیم.
اسلایدرهایی که سه مقاله را در هر اسلاید نشان می دهند.برای حرکت در اسلایدها از دکمه های پشت و بعدی استفاده کنید یا از دکمه های کنترلر اسلاید در انتها برای حرکت در هر اسلاید استفاده کنید.

مشخصات

310 تامین کننده لوله های سیم پیچ فولادی ضد زنگ 10*1 میلی متر

ترکیب شیمیایی

ویژگی های مکانیکی

پروتئین‌های نوترکیب ابریشم عنکبوت (پروتئین‌های ابریشم عنکبوت) کاربردهای بالقوه زیادی در توسعه مواد زیستی جدید دارند، اما ماهیت چندوجهی و مستعد تجمع آن‌ها، دستیابی به آن‌ها و استفاده آسان را دشوار می‌کند.در اینجا ما گزارش می‌کنیم که پروتئین‌های اسپیدروین مینیاتوری نوترکیب و مهمتر از همه، خود دامنه N ترمینال (NT) به سرعت در دمای 37 درجه سانتیگراد هیدروژل‌های خود نگهدار و شفاف را تشکیل می‌دهند.پروتئین های همجوشی متشکل از NT و پروتئین فلورسنت سبز یا پورین نوکلئوزید فسفوریلاز پروتئین های همجوشی کاملاً کاربردی را تشکیل می دهند.هیدروژل هانتایج ما نشان می‌دهد که پروتئین‌های نوترکیب NT و همجوشی بازده بیان بالایی دارند و به هیدروژل‌ها ویژگی‌های جذابی مانند شفافیت، ژل شدن بدون اتصال عرضی و تثبیت مستقیم پروتئین‌های فعال در چگالی بالا می‌دهند.
عنکبوت ها دارای هفت مجموعه مختلف غده ابریشم هستند که هر کدام نوع خاصی از ابریشم را تولید می کنند.هر هفت گونه ابریشم از پروتئین‌های ابریشم عنکبوت (اسپیدروین) به طول تقریبی 6000 بقایای تشکیل شده‌اند و دارای یک ناحیه تکرار مرکزی بزرگ هستند که توسط دامنه‌های کروی N و C ترمینال (NT و CT) احاطه شده است.گسترده ترین نوع ابریشم مورد مطالعه، آمپول اولیه، توسط غده آمپول اولیه تولید می شود.در این غده، تک لایه ای از سلول های اپیتلیال پروتئین های اسپیدروئین را سنتز کرده و آنها را به مجرای غده ترشح می کند، جایی که آنها به شکل محلول (دوپینگ) در غلظت های بسیار بالا (30 تا 50 درصد وزنی در حجم) وجود دارند.سازماندهی و ترکیب پروتئین‌های اسپیدروین آمپولار اصلی در غده مورد بحث قرار گرفته است، اما بیشتر شواهد تجربی وجود یک ترکیب مارپیچ به طور کلی و/یا تصادفی و ساختارهای میسلی یا لایه‌ای را نشان می‌دهند.در حالی که حوزه‌های تکراری خواص مکانیکی الیاف ابریشم را تنظیم می‌کنند، نانوکریستال‌های ورقه‌ای β و ساختارهای آمورف را تشکیل می‌دهند.با کنترل تشکیل ابریشم، 19. دامنه های پایانی از نظر تکاملی حفظ می شوند و عملکرد آنها ممکن است برای همه پروتئین های اسپیدروین مشترک باشد. 2،20،21.در طی عبور از غده، pH اسپیدروئین از حدود 7.6 به < 5.716 کاهش می یابد و با برش و کشش به واسطه حرکت در مجرای باریک تدریجی افزایش می یابد.در محلول، CT یک دایمر موازی سازنده α-مارپیچ 17 است، اما در پاسخ به pH پایین و نیروهای برشی، CT باز می‌شود و لایه‌های β را تغییر می‌دهد. شرایطی که شرایط را در مجرای غده منعکس می کند و حلالیت اسپیدروئین را واسطه می کند، اما در pH کاهش یافته، پروتونه شدن تعدادی از زنجیره های جانبی کربوکسیلیک اسید منجر به دایمر شدن NT با pKa تقریباً 6.5 می شود، در نتیجه NT تثبیت می شود و اسپیدروین در اندازه بزرگ ثابت می شود. مقادیر.شبکه های 16،18.بنابراین، NT نقش کلیدی در تشکیل رشته ایفا می کند و از یک مونومر در پوشش به یک دایمر در فیبر23،24،25 تغییر می کند.NT در تمام شرایطی که تا به امروز مورد مطالعه قرار گرفته است بسیار محلول و مارپیچ باقی می ماند.
پروتئین نوترکیب ابریشم عنکبوت کوچک، متشکل از یک NT، یک منطقه تکرار کوتاه، یک CT، و یک برچسب His6 (His-NT2RepCT) برای خالص سازی، به اندازه پروتئین ابریشم عنکبوت بومی در بافر آبی محلول است و ویژگی های مهم بومی عنکبوت ابریشم را تقلید می کند. .پوشش 25.31.His-NT2RepCT را می توان با استفاده از یک دستگاه بیومیمتیک که در آن یک پوشش محلول با pH 8 در یک حمام آب با pH 525،32،33،34،35 اکسترود می شود، به الیاف پیوسته چرخید.تخمیر بیوراکتور E. coli بیان کننده His-NT2RepCT و پس از آن پس از درمان منجر به عملکرد> 14 گرم در لیتر پس از خالص سازی شد.بازده بالا، حلالیت بالا و پاسخ کافی His-NT2RepCT به شرایط اسیدی همگی به NT23، 25، 34 نسبت داده می شوند.
در اینجا ما تشکیل سریع هیدروژل‌های شفاف را از پروتئین‌های اسپیدروین نوترکیب، از جمله NT به تنهایی، با انکوبه کردن محلول پروتئین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گزارش می‌کنیم.با استفاده از فلورسانس تیوفلاوین T (ThT)، طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR)، طیف‌سنجی تشدید مغناطیسی هسته‌ای (NMR) و میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، متوجه شدیم که پروتئین‌های NT و میکروعنکبوت دچار تبدیل ساختاری به صفحات β و رشته‌های آمیلوئید مانند می‌شوند. زمانی که ژل ها تشکیل می شوند.علاوه بر این، پروتئین های همجوشی NT و پروتئین فلورسنت سبز (GFP) یا پورین نوکلئوزید فسفوریلاز (PNP) هیدروژل هایی را با قطعات همجوشی کاملاً کاربردی تشکیل می دهند.بیان با توان بالا در میزبان های هترولوگ، همراه با تشکیل سریع هیدروژل ها در شرایط فیزیولوژیکی، امکان تولید مقرون به صرفه هیدروژل ها را با عملکردهای مهندسی شده باز می کند.
برخلاف اکثر پروتئین‌های اسپیدروین نوترکیب گزارش شده، His-NT2RepCT در بافر Tris-HCl در pH 8 پایدار است و می‌تواند تا 500 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بدون رسوب تغلیظ شود.بنابراین، ما شگفت زده شدیم که متوجه شدیم که این پروتئین به سرعت هیدروژل های شفاف نوری و خود نگهدار هنگامی که در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه می شود، تشکیل می دهد (شکل 1b-d).مطالعات بیشتر نشان داد که ژل شدن His-NT2RepCT در طیف وسیعی از غلظت های پروتئین (10-300 میلی گرم بر میلی لیتر) رخ می دهد و این غلظت با زمان ژل شدن همبستگی معکوس دارد (شکل 1c و شکل تکمیلی 1).برای یافتن اینکه کدام بخش از His-NT2RepCT واسطه تشکیل هیدروژل است، سپس هر دامنه را به صورت جداگانه و در ترکیبات مختلف با استفاده از روش وارونگی فلاسک بررسی کردیم (شکل 1a,b).تمام بخش های آزمایش شده اسپیدروین نوترکیب ژل (در غلظت پروتئین 300 میلی گرم بر میلی لیتر) را در کمتر از 1 ساعت تشکیل دادند، به جز 2Rep رسوب شده (شکل 1b).این نشان می دهد که NT و CT به تنهایی، در ترکیب، یا همراه با تکرار، می توانند در دمای 37 درجه سانتیگراد ژل کنند و تگ His6 تا حد قابل توجهی بر این فرآیند تأثیر نمی گذارد.با توجه به این تصور رایج که NT یک پروتئین بسیار محلول و پایدار است و گزارش‌های قبلی از هیدروژل‌های اسپیدروین نوترکیب اثرات ژل شدن را به تغییرات ساختاری در مناطق تکراری و/یا CT نسبت می‌دهند، خود NT می‌تواند.کشف ژل غیر منتظره بود.جدول تکمیلی 1) 37، 38، 39. به طور قابل توجهی، NT قبلاً ظرف 10 دقیقه در غلظت ≥ 300 میلی گرم بر میلی لیتر ژل شده است (شکل 1c).آزمایش‌های وارونگی ویال با غلظت‌های مختلف NT نشان داد که در بیش از 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، محلول NT سریع‌تر از His-NT2RepCT در غلظت مربوطه ژل می‌شود (w/v، شکل 1c).
نمایش شماتیک سازه های اسپیدروین مختلف مورد مطالعه در این کار.b زمان ژل در 37 درجه سانتیگراد برای پروتئین های نوترکیب اسپیدروئین مختلف (300 میلی گرم در میلی لیتر) با معکوس کردن ویال تأیید شد.ژل CT بلافاصله بدون انکوباسیون (<300 mg/mL)، رسوب 2Rep (300 mg/mL، مقیاس 5 میلی متر).c زمان ژل His-NT2RepCT و NT در غلظت پروتئین نشان داده شده در 37 درجه سانتی گراد.d عکس های هیدروژل های His-NT2RepCT و NT با عنکبوت و حرف "NT" چاپ شده در زیر، به ترتیب (هر دو 200 میلی گرم در میلی لیتر، نوار مقیاس 5 میلی متر).
هیدروژل های تشکیل شده توسط پروتئین های نوترکیب مختلف اسپیدروئین رنگ های کمی متفاوت دارند و مشاهدات با چشم غیر مسلح درجات مختلفی از شفافیت را نشان می دهد (شکل 1b).ژل های NT بسیار شفاف هستند در حالی که ژل های دیگر مات می شوند.ژل‌های His-NT2RepCT و NT که در لوله‌های استوانه‌ای ریخته می‌شوند، می‌توانند دست نخورده از قالب خارج شوند (شکل 1d).
برای آزمایش اینکه آیا ژل پوشش‌های ابریشم طبیعی عنکبوت تحت شرایطی که اکنون نشان داده شده است که باعث ژل شدن پروتئین‌های اسپیدروین نوترکیب می‌شود یا خیر، پوشش‌هایی از غده آمپول بزرگ عنکبوت پل سوئدی (Larinioides sclopetarius) جمع‌آوری شد.پوشش‌ها در بافر 20 میلی‌مولار Tris-HCl با غلظت 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (بر اساس وزن خشک اندازه‌گیری شده) ذخیره شدند، اما هیچ ژل‌سازی در طول 21 روز انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد مشاهده نشد (شکل تکمیلی 2a).
برای تعیین کمیت این ژل ها، می توان از اندازه گیری های رئولوژیکی برای مطالعه فرآیند ژل شدن و تعیین خواص مکانیکی کلی استفاده کرد.به طور خاص، نظارت بر مدول ذخیره سازی (الاستیسیته) در دماهای بالا می تواند اطلاعاتی در مورد دمای ژل شدن و همچنین خواص ویسکوالاستیک پوشش ارائه دهد.آزمایش‌های افزایش دما (با استفاده از 1 درجه سانتی‌گراد در دقیقه در دمای 25-45 درجه سانتی‌گراد، بر اساس مطالعات قبلی با استفاده از محلول‌های طبیعی ابریشم)40،41 نشان داد که مدول‌های ذخیره‌سازی محلول‌های His-NT2RepCT و NT با افزایش دما افزایش می‌یابد.افزایش یافت (شکل 2 و شکل تکمیلی 3).قابل ذکر است که ماژول NT در دمای پایین تری در مقایسه با His-NT2RepCT شروع به رشد کرد، مطابق با زمان ژل سریعتر مشاهده شده زمانی که NT مستقیماً با His-NT2RepCT در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد (شکل 1).پس از کاهش بعدی دما، مدول ذخیره سازی به مقادیر پایین تر بازنگشت و بالاتر از مدول تلفات باقی ماند (شکل تکمیلی 3 را ببینید)، که نشان دهنده ژل شدن پایدار از نظر حرارتی برگشت ناپذیر است.پس از ژل شدن، مدول الاستیک نهایی از 15 تا 330 کیلو پاسکال برای هیدروژل‌های His-NT2RepCT در غلظت 100 تا 500 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و مدول الاستیک نهایی برای هیدروژل‌های NT (100 تا 500 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) از 2 تا 1400 متغیر بود. کیلو پاسکال (شکل، 2 و داده های رمپ کامل) به شکل تکمیلی 3 مراجعه کنید.
a تغییر دما در طول اندازه گیری His-NT2RepCT (300 میلی گرم در میلی لیتر) و b NT (300 میلی گرم در میلی لیتر) همراه با تکان دادن.فلش‌ها روند دما را نشان می‌دهند و سایه روشن‌تر داده‌های ماژول ذخیره‌سازی آزمایش در مقادیر گشتاور کمتری را برای دستگاه نسبت به تعیین‌شده توسط سازنده نشان می‌دهد که دلیل افزایش نویز است.c تجمع ماژول پایانی His-NT2RepCT و NT پس از دمای بالا (100، 300، و 500 میلی گرم در میلی لیتر).تمام قرائت های ماژول در فرکانس 0.1 هرتز گرفته می شود.
به عنوان یک روش بالقوه برای بررسی تغییرات ساختاری مرتبط با ژل‌سازی، ما طیف‌های FTIR His-NT2RepCT و NT را قبل و بعد از ژل‌سازی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد ثبت کردیم (شکل 3a,b).همانطور که انتظار می‌رفت، طیف محلول‌های His-NT2RepCT و NT با پروتئین‌هایی که ساختار ثانویه سیم پیچ تصادفی α-مارپیچ را نشان می‌دهند، با باند مشخص در 1645 سانتی‌متر مطابقت داشت.برای هر دو هیدروژل، ژل شدن منجر به تشکیل دو بازو در نوار I میانی در حدود 1617 سانتی‌متر-1 و 1695 سانتی‌متر-1 شد (شکل 3a، b)، که نشان‌دهنده تشکیل ساختارهای ورقه β ضد موازی است.این تغییرات همچنین می‌تواند به وضوح در مشتقات دوم و طیف‌های مختلف ژل‌سازی مربوطه دیده شود (شکل تکمیلی 4b).دو باند لایه β NT نسبت به His-NT2RepCT برجسته‌تر بودند، که نشان می‌دهد محتوای کل باندهای لایه β در هیدروژل NT بیشتر از هیدروژل NT2RepCT است.
یک طیف جذبی FTIR His-NT2RepCT و b NT (هر دو 500 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) قبل از (محلول) و پس از (ژل) انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد.c تصاویر TEM از ژل های NT2RepCT 50 mg/ml معلق و d NT.نوار مقیاس 200 نانومتر.قطر فیبر هیدروژل های His-NT2RepCT و NT.n = 100 فیبریل اندازه گیری شده، p <0.0001.نوارهای خطا انحراف معیار را نشان می دهند.مرکز نوارهای خطا میانگین است.برای تجزیه و تحلیل آماری از آزمون t غیر جفتی (دو دنباله) استفاده شد.f ThT فلورسانس پروتئین های نوترکیب اسپیدروئین مختلف (100 میلی گرم در میلی لیتر) در دمای 37 درجه سانتی گراد بدون تکان دادن.آزمایشات تلقیح گرم NT (100 میلی گرم در میلی لیتر) از ژل NT 100 میلی گرم در میلی لیتر با دانه های 0، 5، 10 و 20 درصد.
تجزیه و تحلیل ژل با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نشان داد که هیدروژل از فیبرهای آمیلوئید مانند تشکیل شده است (شکل 3c، 3d).فیبریل های تشکیل شده با NT دراز (قطر 5-12 نانومتر) و بدون انشعاب بودند، در حالی که فیبرهای His-NT2RepCT از نظر طول کوتاه تر و به طور قابل توجهی از نظر قطر گسترده تر (7-16 نانومتر) بودند (شکل 3e).این نتایج به ما اجازه داد تا سینتیک فیبروز را با استفاده از روش تیوفلاوین T (ThT) دنبال کنیم.برای همه پروتئین‌های اسپیدروین نوترکیب، سیگنال فلورسنت هنگامی که نمونه‌ها در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند افزایش یافت (شکل 3f، شکل تکمیلی 5a).مطابق با این یافته، بررسی میکروسکوپی NT و His-NT2RepCT تحت شرایط ژل، افزایش یکنواخت در فلورسانس ThT را بدون تجمع موضعی قابل توجه دانه های ThT مثبت نشان داد (شکل تکمیلی 5b,c).تشکیل فیبریل‌های ThT مثبت با افزایش کدورت NT و His-NTCT همراه نبود (تصویر تکمیلی 5d)، به این معنی که شبکه‌ای از فیبریل‌ها در ژل می‌تواند بدون به خطر انداختن شفافیت ژل تشکیل شود.کاشت با افزودن مقادیر کمی از فیبریل های از پیش ساخته شده می تواند به طور قابل توجهی تشکیل فیبریل برخی از آمیلوئیدها را تسریع کند.اثر کاشت (شکل 3g).شاید این به این دلیل است که فیبرهای موجود در هیدروژل نسبتاً ثابت هستند و نمی توان از آنها به عنوان دانه استفاده کرد.
رفتار غیرمنتظره پروتئین‌های اسپیدروین نوترکیب در دماهای بالا، مطالعات طیف‌سنجی تشدید مغناطیسی هسته‌ای (NMR) را برای شناسایی تغییرات ساختاری مرتبط با تشکیل ژل انجام داد.طیف NMR محلول های His-NT2RepCT ثبت شده در طول زمان در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که CT هنوز تا حدی تا شده است، در حالی که سیگنال های NT و 2Rep ناپدید شده بودند (شکل 4a)، که نشان می دهد عمدتاً NT و 2Rep بودند که تا حدی تشکیل His- را کنترل می کردند. هیدروژل NT2RepCT.سیگنال CT نیز تا 20 درصد از شدت اولیه خود کاهش یافته است، که نشان می دهد CT نیز عمدتاً ثابت و در ساختار هیدروژل گنجانده شده است.برای بخش کوچک‌تری از CT، که به اندازه نمونه پیش‌انکوبه‌شده متحرک است و در نتیجه با محلول NMR مشاهده می‌شود، طیف‌ها فاقد سیگنال برای 10 باقیمانده ساختاری اولیه هستند، احتمالاً به دلیل تثبیت دشوار بخش متصل His-NT2Rep.طیف NMR حالت هیدروژل ها -NT2RepCT حضور غالب مارپیچ های α و لایه های β و تا حدی کمتر، ترکیب سیم پیچ تصادفی را نشان داد (شکل 4b).تجزیه و تحلیل شیمی شیفت بقایای متیونین موجود فقط در NT نشان داد که این دامنه به ساختار β-ورق تبدیل شده است.طیف وابسته به زمان NT در محلول کاهش یکنواختی را در شدت سیگنال نشان داد (شکل 4c)، و NMR حالت جامد هیدروژل های NT نشان داد که بیشتر باقیمانده های NT به ساختارهای ورقه β تبدیل شده اند (شکل 4d).انطباق 2Rep به دلیل تمایل آن به تجمع نمی تواند به طور جداگانه تعیین شود.با این حال، طیف NMR حالت جامد هیدروژل های NTCT و His-NT2RepCT بسیار شبیه به نظر می رسید (شکل 4b؛ شکل تکمیلی 6b)، که نشان می دهد 2Rep سهم کمی در بخش ساختاری هیدروژل His-NT2RepCT دارد.برای هیدروژل‌های CT، مارپیچ‌های α، صفحات β، و ساختارهای ثانویه مارپیچی تصادفی وجود دارند (شکل تکمیلی 6d).این نشان می دهد که برخی از قسمت های CT به شکل α-مارپیچ باقی می مانند در حالی که برخی دیگر به صفحات β تبدیل می شوند.بنابراین، نتایج طیف‌سنجی NMR نشان می‌دهد که NT برای تشکیل هیدروژل مهم است و همچنین پس از ادغام با 2Rep و CT به یک ترکیب ورق β تبدیل می‌شود.مطابق با این، اخیراً دریافتیم که زیپ‌های فضایی آمیلوئید احتمالاً در هر پنج مارپیچ حوزه NT تشکیل می‌شوند و الگوریتم والتز یک ناحیه آمیلوئیدوژنیک را در مارپیچ 1 پیش‌بینی می‌کند (شکل 4e).
طیف دو بعدی محلول 15N-HSQC 10 میلی گرم بر میلی لیتر His-NT2RepCT قبل از (آبی) و 19 ساعت پس از انکوباسیون (قرمز) در دمای 37 درجه سانتی گراد.پیک های متقاطع منفرد در طیف قرمز و F24، G136، polyA در طیف آبی با نمادهای اسید آمینه تک حرفی و اعداد باقیمانده نشان داده می شوند.ورودی‌ها وابستگی شدت سیگنال به زمان را برای باقیمانده‌های انتخاب شده از حوزه‌های NT، 2Rep و CT نشان می‌دهند.ب طیف فرکانس رادیویی حالت جامد (RFDR) هیدروژل های His-NT2RepCT.همبستگی باقی‌مانده‌های Ca/Cβ مشاهده‌شده در طیف‌های RFDR با مقایسه با تغییرات شیمیایی پپتید مدل و مقادیر مشتق‌شده از آمار 82،83 و ساختارهای ثانویه آنها تعیین شد.SSB - باند جانبی چرخان.c طیف تک بعدی 15N-HSQC 10 mg/mL محلول NT در طول انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 36 ساعت.ورودی شدت حجمی را در مقابل زمان نشان می دهد.d طیف RFDR حالت جامد هیدروژل های NT.ارتباط باقی مانده های Ca / Cβ و ساختارهای ثانویه آنها مشاهده شده در طیف RFDR نشان داده شده است.e بر اساس نمایه تمایل فیبریلاسیون NT45.79 از پایگاه داده Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).انرژی روزتا پنجره تغییر رعد و برق فضایی هگزاپپتید بر حسب کیلوکالری در مول نشان داده شده است.نوارهای قرمز نشان دهنده هگزاپپتیدهایی با تمایل فیبروزی بالا هستند (انرژی روزتا زیر 23- کیلو کالری در مول؛ زیر خط نقطه چین).نوارهای سبز نشان دهنده قطعاتی با انرژی روزتا در بالای آستانه هستند و بنابراین احتمال تشکیل زیپ های فضایی کمتر است.قطعات حاوی پرولین از تجزیه و تحلیل حذف شدند (بدون ستون).مربع ها مناطقی از آمیلوئیدوز را نشان می دهند که توسط الگوریتم والتز 81 (https://waltz.switchlab.org) پیش بینی شده است.دنباله بقایای اسید آمینه NT در بالا قرار دارد و انواع باقیمانده‌های موجود در ساختار ثانویه β (تعیین شده توسط طیف‌سنجی NMR حالت جامد) با رنگ قرمز نشان داده شده‌اند.موقعیت پنج NT α-مارپیچ به عنوان (H1-H5) 28 تعیین شده است.
در pH <6.5، HT دیمر می شود و در برابر دناتوراسیون ناشی از گرما یا اوره مقاوم است.برای روشن شدن اینکه چگونه دایمر شدن و پایداری NT بر ژل شدن تأثیر می گذارد، محلول های حاوی 100 میلی گرم در میلی لیتر NT در pH 8، 7 و 6 با استفاده از آزمون وارونگی ویال کنترل شدند.نمونه های NT در pH 8 و 7 پس از 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد ژل شدند، اما ژل pH 8 شفاف باقی ماند، در حالی که ژل pH 7 رسوب قابل مشاهده ای را نشان داد (شکل 5a).در مقابل، یک محلول حاوی HT در pH 6 ژل تشکیل نداد و یک رسوب بزرگ بعد از 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد مشاهده شد.این نشان می دهد که خود دایمرها و/یا پایداری بالاتر آنها در مقایسه با مونومرها از ژل شدن جلوگیری می کند.تشکیل رسوب برای NT در pH 7 و 6 انتظار نمی رفت، زیرا گزارش شده است که NT در 200 میلی گرم بر میلی لیتر 27 محلول است، به راحتی پس از دناتوره شدن گرما دوباره تا می شود و همچنین مارپیچ α را در مقادیر پایین تر حفظ می کند. pH 18. توضیح محتمل برای این اختلافات این است که آزمایش‌های گزارش‌شده قبلی در دمای اتاق یا پایین‌تر یا در غلظت‌های نسبتاً کم پروتئین انجام شده‌اند.16،18،19.
تست وارونگی ویال NT (100 میلی گرم بر میلی لیتر) در pH 8، 7، 6 و 154 میلی مولار NaCl (pH 8) پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد.b طیف NT CD با و بدون 154 میلی مولار NaF و 154 میلی مولار NaCl به ترتیب.بیضی مولی در 222 نانومتر به نسبت چین های طبیعی تبدیل می شود.c سنجش وارونگی NT (100 میلی گرم در میلی لیتر) NT* (37 درجه سانتی گراد و 60 درجه سانتی گراد)، NTA72R (37 درجه سانتی گراد) و His-NT-L6 (37 درجه سانتی گراد و 60 درجه سانتی گراد).d طیف CD جهش یافته های NT NT*، NTA72R و His-NT-L6.بیضی مولی در 222 نانومتر به نسبت چین های طبیعی تبدیل می شود.تست وارونگی NTFlSp، NTMiSp و کاهش یافته NTMiSp (100 میلی گرم در میلی لیتر).نوار مقیاس 5 میلی متر.f طیف های CD NT، NTFlSp، NTMiSp و NTMiSp کاهش یافته.بیضی مولی در 222 نانومتر به نسبت چین های طبیعی تبدیل می شود.طیف کامل NT در دمای 25 درجه سانتیگراد و 95 درجه سانتیگراد در شکل تکمیلی 8 نشان داده شده است.
غلظت نمک فیزیولوژیکی برهمکنش های الکترواستاتیکی بین زیرواحدهای NT و دیمریزاسیون انتقال NT به pH18 پایین را تعیین می کند.ما دریافتیم که وجود 154 میلی مولار NaCl و NaF واقعاً به ترتیب ژل شدن را مهار می‌کند (شکل 5a، b؛ شکل تکمیلی 2b) و این نمک‌ها پایداری حرارتی مونومرهای NT را افزایش می‌دهند (شکل 5b، شکل تکمیلی 8). .همچنین نشان می دهد که افزایش پایداری، به جای دیمریزاسیون، از تشکیل ژل جلوگیری می کند.
برای بررسی بیشتر نقش دایمر شدن پروتئین و پایداری در ژل شدن، از دو جهش NT* و NTA72R استفاده کردیم که در pH28.30 کم نیز مونومر باقی می مانند.NT* یک جهش معکوس بار دوگانه است که در آن توزیع بار دوقطبی ظاهری مونومر مسطح شده است، که از دایمر شدن جلوگیری می کند و پایداری مونومر را به شدت افزایش می دهد.NTA72R یک دوقطبی باردار است، اما Ala جایگزین شده با ارگ در مرز دایمر قرار دارد، بنابراین جهش‌ها با برهمکنش‌های زیرواحد مورد نیاز برای دیمرسازی تداخل می‌کنند.پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، NT* یک هیدروژل تشکیل نداد، در حالی که NTA72R یک ژل مات به مدت 15 دقیقه تشکیل داد (شکل 5c).از آنجایی که هر دو NT* و NTA72R نمی توانند دیمر شوند اما در پایداری مونومر متفاوت هستند (شکل 5d)، این نتایج به شدت نشان می دهد که پایداری ترمودینامیکی بالا از ژل شدن NT جلوگیری می کند.این همچنین توسط این واقعیت پشتیبانی می شود که HT* هنگامی که در دمای بالا ناپایدار است (پس از 8 دقیقه در 60 درجه سانتیگراد؛ شکل 5c) یک ژل تشکیل می دهد.قبلاً نشان داده شده بود که محتوای بالای متیونین در NT تاخوردگی طبیعی آن را مایع می کند و شش جانشین Met to Leu (که در اینجا به عنوان His-NT-L6 نامیده می شود) به شدت مونومر NT46 را تثبیت می کنند.بر اساس این فرض که انعطاف ساختاری برای تشکیل ژل NT لازم است، دریافتیم که جهش یافته پایدار His-NT-L6 در دمای 37 درجه سانتیگراد ژل نمی شود (شکل 5c, d).با این حال، His-NT-L6 همچنین پس از انکوباسیون در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه، ژل تشکیل داد (شکل 5c).
به نظر می رسد توانایی NT برای تبدیل به ساختارهای ورقه β و تشکیل هیدروژل در برخی اما نه همه حوزه های NT اسپیدروین اعمال می شود.NT ها از انواع مختلف ابریشم و گونه های عنکبوت، Trichonephila clavipes (NTFlSp)، علیرغم محتوای نسبتاً کم متیونین و پایداری حرارتی بالا، ژل تشکیل دادند (شکل 5e، f و جدول تکمیلی 2).در مقابل، NT از اسپیدروین پروتئین آمپولار کوچک از Araneus ventricosus (NTMiSp) با پایداری حرارتی کم و محتوای متیونین بالا، هیدروژل را تشکیل نداد (جدول تکمیلی 2 و شکل 5e، f).مورد دوم ممکن است با حضور پیوندهای دی سولفید درون مولکولی مرتبط باشد29،47.به طور مداوم، زمانی که پیوندهای دی سولفیدی NTMiSp کاهش یافت، پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه، هیدروژل تشکیل داد (شکل 5e).در پایان، لازم به ذکر است که انعطاف پذیری ساختاری یک معیار مهم، اما نه تنها، برای تشکیل ژل از NT است.عامل دیگری که ممکن است مرتبط باشد تمایل به تشکیل فیبرهای آمیلوئید است و تجزیه و تحلیل با پایگاه داده زیپ و الگوریتم والتز ارتباط بین توانایی تشکیل ژل و حضور مناطق آمیلوئیدوژنیک و همچنین وسعت مناطق پیش بینی شده را نشان داد. برای تشکیل زیپ های استریکیک همبستگی وجود داشت (جدول تکمیلی 2 و شکل تکمیلی 9).
توانایی NT برای تشکیل فیبریل و تشکیل ژل در شرایط مساعد ما را به این فرض سوق داد که همجوشی NT با سایر قطعات پروتئینی همچنان می تواند ژل هایی با عملکرد کامل شرکای همجوشی تشکیل دهد.برای آزمایش این، پروتئین فلورسنت سبز (GFP) و پورین نوکلئوزید فسفوریلاز (PNP) را به ترتیب در C-پایانه NT معرفی کردیم.پروتئین های همجوشی حاصل در E. coli با بازده نهایی بسیار بالا بیان شدند (150 میلی گرم در لیتر و 256 میلی گرم در لیتر کشت فلاسک تکان دهنده به ترتیب برای His-NT-GFP و His-NT-PNP)، مطابق با آنچه نشان داده شده است. برای سایر پروتئین های ذوب شده به NT Ref.30. پروتئین های همجوشی His-NT-GFP (300mg/mL) و His-NT-PNP (100mg/mL) پس از 2 ساعت و 6.5 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد ژل تشکیل دادند و مهمتر از همه، کسر GFP بدون تغییر باقی ماند.پس از ژل شدن مشاهده شد، با بیش از 70 درصد از شدت فلورسانس اولیه پس از ژل شدن باقی مانده است (شکل 6a).برای اندازه‌گیری فعالیت PNP در محلول‌ها و ژل‌های his-NT-PNP، مجبور شدیم پروتئین فیوژن را با NT رقیق کنیم زیرا فعالیت آنزیمی آماده‌سازی خالص خارج از محدوده تشخیص سنجش در غلظت‌های ژل‌سازی بود.ژل تشکیل شده با مخلوطی حاوی 0.01 میلی گرم در میلی لیتر His-NT-PNP و 100 میلی گرم در میلی لیتر NT، 65 درصد از فعالیت آنزیمی اولیه نمونه های پیش انکوبه شده را حفظ کرد (شکل 6b).ژل در طول اندازه گیری دست نخورده باقی ماند (شکل تکمیلی 10).
یک شدت فلورسانس نسبی قبل و بعد از ژل شدن His-NT-GFP (300 میلی گرم در میلی لیتر) و ویال معکوس حاوی هیدروژل His-NT-GFP (300 میلی گرم در میلی لیتر) تحت نور مرئی و UV.نقاط اندازه گیری های فردی را نشان می دهند (n = 3)، نوارهای خطا انحراف استاندارد را نشان می دهند.مقدار متوسط ​​در مرکز نوارهای خطا نشان داده شده است.b فعالیت PNP با تجزیه و تحلیل فلورومتری با استفاده از محلول ها و ژل های متشکل از NT (100 میلی گرم در میلی لیتر) و مخلوطی حاوی 0.01 میلی گرم در میلی لیتر his-NT-PNP و 100 میلی گرم در میلی لیتر دلار جدید تایوان به دست آمد.داخل یک ویال معکوس حاوی هیدروژل حاوی His-NT-PNP (نوار مقیاس 5 میلی متر) را نشان می دهد.
در اینجا، ما تشکیل هیدروژل‌ها از NT و سایر پروتئین‌های اسپیدروین نوترکیب را با انکوبه کردن محلول پروتئینی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گزارش می‌کنیم (شکل 1).ما نشان می‌دهیم که ژل شدن با تبدیل مارپیچ‌های α به لایه‌های β و تشکیل فیبریل‌های آمیلوئید مانند مرتبط است (شکل‌های 3 و 4).این یافته شگفت‌انگیز است زیرا NTها بسته‌های مارپیچی کروی پیچیده‌ای هستند که به دلیل حلالیت بسیار بالا و پایداری بالا در غلظت‌های بیش از 200 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در دمای 4 درجه سانتی‌گراد برای چند روز شناخته می‌شوند.علاوه بر این، NT ها به راحتی پس از دناتوره شدن حرارتی در غلظت های کم پروتئین در میکرومولار تا می شوند.با توجه به نتایج ما، تشکیل فیبریل نیاز به ترکیبی از غلظت پروتئین بیش از 10 میلی گرم در میلی لیتر و دمای کمی بالا دارد (شکل 1).این با این ایده مطابقت دارد که فیبرهای آمیلوئید می‌توانند از پروتئین‌های کروی چین خورده تشکیل شوند که به دلیل نوسانات حرارتی در شرایط فیزیولوژیکی در حالت نیمه باز شده هستند.نمونه هایی از پروتئین هایی که تحت این تبدیل قرار می گیرند عبارتند از انسولین 49،50، β2-میکروگلوبولین، ترانس تیرتین و لیزوزیم 51،52،53.اگرچه NT یک مارپیچ α در حالت اصلی خود است، تقریباً 65٪ از زنجیره پلی پپتیدی با تشکیل زیپ فضایی سازگار است (شکل 4e) 45.از آنجایی که مونومر به صورت پویا متحرک است، می‌تواند این نواحی آمیلوئیدوژنیک بالقوه را در دماهای نسبتاً بالا نشان دهد و در غلظت‌های بالای پروتئین کل می‌تواند به غلظت بحرانی برای تشکیل فیبریل آمیلوئید برسد.به دنبال این استدلال، ما یک همبستگی منفی بین غلظت اسپیدروئین و زمان ژل شدن پیدا کردیم (شکل 1c)، و اگر ترکیب NT مونومر یا با جهش (NT*, His-NT-L6) یا با افزودن نمک تثبیت شود، می‌تواند از هیدروژل های تشکیل (شکل 5).
در بیشتر موارد، فیبرهای آمیلوئید به صورت رسوب از محلول ناپدید می شوند، اما تحت شرایط خاصی می توانند هیدروژل های 55،56،57 را تشکیل دهند.فیبرهای تشکیل دهنده هیدروژل معمولاً نسبت ابعاد بالایی دارند و شبکه های سه بعدی پایداری را از طریق درهم تنیدگی مولکولی تشکیل می دهند که مطابق با نتایج ما است.برای تشکیل هیدروژل در شرایط آزمایشگاهی، پروتئین ها اغلب به طور کامل یا جزئی باز می شوند، به عنوان مثال، با قرار گرفتن در معرض حلال های آلی، دمای بالا (70-90 درجه سانتی گراد) و / یا pH پایین (1.5-3.0) 59،60،61،62.هیدروژل‌های اسپیدروین که در اینجا توضیح داده می‌شوند، نیازی به پردازش سخت ندارند، و همچنین به عوامل پیوند متقابل برای تثبیت هیدروژل‌ها نیاز ندارند.
قبلاً گزارش شده بود که تکرارهای اسپیدروین و QD ها، که به نظر می رسد در طول ریسندگی ابریشم تحت تغییر برگه β قرار می گیرند، هیدروژل تشکیل می دهند.در مقایسه با یافته های ما، زمان انکوباسیون و/یا دمای جوجه کشی به ترتیب به طور قابل توجهی طولانی تر یا بالاتر بود و هیدروژل های حاصل اغلب مات بودند (شکل 7 و جدول تکمیلی 1) 37، 38، 63، 64، 65، 66، 67، 68 69. علاوه بر زمان‌های سریع ژل، هیدروژل‌های NT > 300 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (30%) از سایر هیدروژل‌های پروتئین ابریشم نوترکیب عنکبوت توصیف شده و همچنین هیدروژل‌های طبیعی مانند ژلاتین، آلژینات (2%)، آگار (0.5٪) بهتر عمل کردند. ) و کلاژن.(0.6%) (شکل 7 و جداول تکمیلی 1 و 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
زمان ژل و مدول الاستیک هیدروژل ها در این مطالعه با سایر هیدروژل های مبتنی بر اسپیدروئین و هیدروژل های طبیعی انتخاب شده مقایسه شد.منابع همراه با شرح شرایط ژل شدن آورده شده است.APS پرسولفات آمونیوم، دمای اتاق.داده های 37، 38، 39، 64، 65، 66، 67، 68، 69، 70، 71، 72، 73، 74.
به نظر می رسد عنکبوت ها راه هایی برای جلوگیری از ژل شدن اسپیدروین در طول ذخیره سازی ایجاد کرده اند.علیرغم غلظت بالای پروتئین در غده ابریشم، ناحیه تکرار بزرگ مرتبط با دامنه انتهایی به این معنی است که غلظت ظاهری NT و CT در غده تقریباً 10-20 میلی گرم در میلی لیتر در مرز این مطالعه است.برای تشکیل هیدروژل مشاهده شده در شرایط آزمایشگاهی مورد نیاز است.علاوه بر این، غلظت های مشابه نمک 16 مانند غدد ابریشم، NT را تثبیت کرد (شکل 5b).ترکیب NT در سیتوزول E. coli مورد مطالعه قرار گرفته است و مشخص شده است که نسبت به زمانی که در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می‌گیرد، محکم‌تر تا شده است، که بیشتر نشان می‌دهد که نمک یا سایر عوامل از تجمع آن در داخل بدن جلوگیری می‌کنند.با این حال، توانایی NT ها برای تبدیل به فیبرهای ورقه β ممکن است برای تشکیل رشته مهم باشد و باید در مطالعات آینده مورد بررسی قرار گیرد.
علاوه بر جنبه های جدید تشکیل فیبریل و هیدروژل شبه NT-آمیلوئید مشاهده شده در این مطالعه، ما همچنین نشان می دهیم که این پدیده ممکن است کاربردهای بیوتکنولوژیکی و زیست پزشکی داشته باشد (شکل 8).به عنوان اثبات مفهوم، ما NT را با GFP یا PNP ترکیب کردیم و نشان دادیم که پروتئین همجوشی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود و بخش‌های GFP و PNP تا ​​حد زیادی فعالیت خود را پس از ژل شدن حفظ می‌کنند (شکل 6).نوکلئوزید فسفوریلازها کاتالیزورهای مهم سنتز آنالوگهای نوکلئوزیدی هستند که کشف ما را برای صنعت بیوداروسازی مرتبط می سازد.مفهوم بیان پروتئین های همجوشی که هیدروژل های شفاف را در شرایط مطلوب تشکیل می دهند، امکان ایجاد هیدروژل های عامل دار با خواص مطلوب را برای طیف گسترده ای از کاربردها مانند تثبیت آنزیم، آزادسازی کنترل شده دارو و مهندسی بافت فراهم می کند.علاوه بر این، NT و NT* نشانگرهای بیان کارآمدی هستند30، به این معنی که NT و انواع آن می‌توانند برای تولید پرتوان پروتئین‌های همجوشی محلول و ایجاد متعاقب آن پروتئین‌های هدف تثبیت‌شده در هیدروژل‌های سه‌بعدی استفاده شوند.
NT محلول، α-مارپیچ و پایدار در غلظت های پایین (μM) و 37 درجه سانتی گراد است.در همان دما، اما در غلظت های فزاینده (بیش از 10 میلی گرم در میلی لیتر)، NT ژل هایی متشکل از فیبریل های آمیلوئیدی تشکیل می دهد.پروتئین های همجوشی NT همچنین ژل های فیبریلار را با قطعات همجوشی کاملاً کاربردی تشکیل می دهند که به پروتئین های مختلف اجازه می دهد در هیدروژل های سه بعدی با استفاده از NT بی حرکت شوند.پایین: NT (PDB: 4FBS) و تصاویر شبکه‌های فیبر و ساختارهای پروتئین مرتبط (فرض شده و به مقیاس ترسیم نشده است، GFP PDB: 2B3Q، 10.2210/pdb2B3Q/pdb؛ PNP PDB: 4RJ2، 10.2pdbd21).
سازه ها (برای فهرست کامل شامل توالی های اسید آمینه به جدول تکمیلی 4 مراجعه کنید) در پلاسمید pT7 کلون شده و به E. coli BL21 (DE3) تبدیل شدند.E. coli حاوی پلاسمیدهای مهندسی شده در لوریا براث حاوی کانامایسین (70 میلی گرم در لیتر) تلقیح شدند و در طول شب در دمای 30 درجه سانتی گراد و 250 دور در دقیقه رشد کردند.سپس کشت 1/100 به محیط LB حاوی کانامایسین تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی گراد و 110 دور در دقیقه کشت داده شد تا OD600 به 0.8 برسد.برای مطالعات NMR، باکتری ها در محیط حداقل M9 حاوی 2 گرم D-گلوکز 13C (آلدریچ) و 1 گرم کلرید آمونیوم 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) برای برچسب زدن پروتئین با ایزوتوپ ها رشد کردند.دما را به 20 درجه سانتیگراد کاهش دهید و بیان پروتئین را با 0.15 میلی مولار ایزوپروپیل تیوگالاکتوپیرانوسید (غلظت نهایی) القا کنید.پس از بیان پروتئین یک شبه، سلول ها در گرمای 7278 × گرم، 4 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه برداشت شدند.گلوله های سلولی در 20 میلی مولار Tris-HCl، pH 8 مجدداً معلق شدند و تا استفاده بعدی منجمد شدند.سلول های ذوب شده با استفاده از یک مختل کننده سلول (ماشین های سری TS، Constant Systems Limited، انگلستان) در 30 کیلو پاسکال لیز شدند.سپس لیزات در 25000 گرم به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند.برای NTMiSp، گلوله سپس در 2 مولار اوره، 20 میلی مولار Tris-HCl، pH 8 مجدداً معلق شد و به مدت 2 دقیقه (2 ثانیه روشن/خاموش، 65%) تحت فراصوت قرار گرفت، سپس دوباره در 25000 xg، 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد. 30 دقیقه.مایع رویی بر روی یک ستون Ni-NTA بارگذاری شد، با 20 میلی مولار Tris-HCl، 2 میلی مولار ایمیدازول، pH 8 شسته شد و در نهایت پروتئین با 20 میلی مولار Tris-HCl، 200 میلی مولار ایمیدازول، pH 8 شسته شد. برای تولید NT2RepCT و NTCT، هضم ترومبین محل (ThrCleav) بین His و NT را معرفی می کند.محل های برش ترومبین در His-NT-ThrCleav-2Rep (تولید 2Rep)، His-thioredoxin-ThrCleav-NT (تولید NT)، His-thioredoxin-ThrCleav-CT (تولید CT)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NT نیز وجود دارد. .* (تولید کننده NT*)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (تولید NTA72R)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (تولید کننده NTF1Sp) و His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (تولید می کند).سازه ها با ترومبین (1:1000) هضم شدند و یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد با 20 میلی مولار Tris-HCl، pH 8، با استفاده از غشای دیالیز Spectra/Por با آستانه وزن مولکولی 6-8 کیلو دالتون دیالیز شدند.پس از دیالیز، محلول بر روی ستون Ni-NTA بارگذاری می شود و پساب حاوی پروتئین مورد نظر جمع آوری می شود.غلظت پروتئین با اندازه گیری جذب UV در 280 نانومتر با استفاده از ضریب انقراض هر پروتئین، به جز NTF1Sp که از روش برادفورد طبق پروتکل سازنده استفاده می کرد، تعیین شد.خلوص با استفاده از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید SDS (4-20%) و رنگ آمیزی آبی درخشان Coomassie تعیین شد.پروتئین ها با استفاده از فیلترهای سانتریفیوژ (VivaSpin 20، GE Healthcare) در 4000 xg با وزن مولکولی 10 کیلو دالتون در سیکل های 20 دقیقه ای تغلیظ شدند.
محلول پروتئین را ذوب کرده و 150 میکرولیتر را با دقت در یک ویال سپتوم شفاف 1 میلی لیتری (8×40 میلی متر Thermo Scientific) پیپ کنید.لوله ها درپوش و با پارافیلم مهر و موم شدند تا از تبخیر جلوگیری شود.نمونه (n = 3) در 37 درجه سانتیگراد یا 60 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و به صورت دوره ای برای مشاهده ژل شدن معکوس شدند.نمونه هایی که ژل نداشتند حداقل به مدت یک هفته انکوبه شدند.پیوندهای دی سولفید NTMiSp را با 10 میلی مولار DTT در هر 10 میکرومولار پروتئین کاهش دهید.برای تجزیه و تحلیل ژل شدن پوشش‌های ابریشم طبیعی عنکبوت، عنکبوت پل سوئدی بریده شد، دو غده آمپول شده اصلی در 200 میکرولیتر بافر 20 میلی‌مولاری Tris-HCl با pH 8 قرار داده شدند و برش داده شدند تا پوشش از غدد جدا شود..محتویات غدد در بافر، 50 میکرولیتر برای تعیین وزن خشک (با انکوباسیون ویال های باز در دمای 60 درجه سانتیگراد تا وزن ثابت) و 150 میکرولیتر برای ژل شدن در دمای 37 درجه سانتیگراد، حل می شود.
هندسه / ابزار اندازه گیری از فولاد ضد زنگ با استفاده از یک صفحه موازی با قطر بالایی 20 میلی متر و شکاف 0.5 میلی متر ساخته شده است.نمونه را از 25 درجه سانتیگراد تا 45 درجه سانتیگراد و با سرعت 1 درجه سانتیگراد در دقیقه با استفاده از صفحه پلتیر کف فولادی ضد زنگ به دمای 25 درجه سانتیگراد برگردانید.اندازه‌گیری‌های ارتعاشی در فرکانس 0.1 هرتز و در ناحیه ویسکوالاستیک خطی ماده در کرنش 5% و 0.5% برای نمونه‌های 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و 300 تا 500 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به ترتیب انجام شد.از یک محفظه رطوبت سفارشی برای جلوگیری از تبخیر استفاده کنید.داده ها با استفاده از Prism 9 تجزیه و تحلیل شدند.
برای جمع آوری طیف های مادون قرمز (IR) در دمای اتاق از 800 تا 3900 سانتی متر-1.دستگاه ATR و همچنین مسیر نور از طریق طیف‌سنج، قبل و در طول آزمایش با هوای فیلتر شده خشک پاک می‌شود.محلول‌هایی (500 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر برای به حداقل رساندن پیک جذب آب در طیف‌ها) روی کریستال‌ها پیپت شدند و ژل‌هایی (500 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) قبل از اندازه‌گیری تشکیل شد و سپس به کریستال‌ها (3 نفر) منتقل شدند.1000 اسکن با وضوح 2 cm-1 و چرخه کار صفر 2 ثبت شد. مشتق دوم با استفاده از OPUS (Bruker) با استفاده از محدوده هموارسازی 9 نقطه محاسبه شد.طیف ها با استفاده از F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" بین 1720 و 1580 cm-1 به همان منطقه ادغام نرمال شدند.در طیف‌سنجی ATR-IR، عمق نفوذ یک پرتو مادون قرمز به یک نمونه وابسته به عدد موج است، که منجر به جذب قوی‌تر در تعداد موج‌های پایین‌تر نسبت به تعداد موج‌های بالاتر می‌شود.این اثرات برای طیف های نشان داده شده در شکل ها تصحیح نشده اند.3 زیرا آنها بسیار کوچک هستند (تصویر تکمیلی 4).طیف های تصحیح شده برای این رقم با استفاده از نرم افزار Bruker OPUS محاسبه شد.
در اصل، یک کمی سازی جامع از ترکیبات پروتئین پس از دکانولوشن قابل اعتماد اجزاء در قله آمید I امکان پذیر است.با این حال، برخی از موانع در عمل به وجود می آید.نویز در طیف می تواند به صورت پیک (کاذب) در حین دکانولوشن ظاهر شود.علاوه بر این، پیک ناشی از خمش آب با موقعیت قله آمید I منطبق است و ممکن است برای نمونه های حاوی مقدار زیادی آب، مانند ژل آبی که در اینجا مورد مطالعه قرار گرفته است، بزرگی مشابهی داشته باشد.بنابراین، ما تلاشی برای تجزیه کامل قله آمید I نکردیم و مشاهدات ما فقط باید در حمایت از روش‌های دیگر مانند طیف‌سنجی NMR در نظر گرفته شود.
محلول های 50 میلی گرم بر میلی لیتر NT و His-NT2RepCT یک شبه در دمای 37 درجه سانتی گراد ژل شدند.سپس هیدروژل با 20 میلی مولار Tris-HCl (pH 8) تا غلظت 12.5 میلی گرم بر میلی لیتر رقیق شد، به خوبی تکان داده شد و برای شکستن ژل پیپت شد.سپس، هیدروژل 10 بار با 20 میلی مولار Tris-HCl (PH 8) رقیق شد، 5 میکرولیتر از نمونه بر روی شبکه مسی پوشیده شده با فرمور اعمال شد و نمونه اضافی با کاغذ بلات حذف شد.نمونه ها دو بار با 5 میکرولیتر آب MilliQ شسته و با فرمت اورانیل 1 درصد به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند.لکه اضافی را با کاغذ جاذب پاک کنید، سپس توری را با هوا خشک کنید.تصویربرداری بر روی این شبکه ها با استفاده از یک FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN که در 100 کیلو ولت کار می کند، انجام شد.تصاویر با بزرگنمایی 26500 x و 43000 x با استفاده از یک دوربین CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions، GmbH، Münster، آلمان) ثبت شدند.برای هر نمونه (1=n)، 10-15 تصویر ثبت شد.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) برای تجزیه و تحلیل تصویر و اندازه گیری قطر فیبر (n = 100، فیبرهای مختلف) استفاده شد.از منشور 9 برای انجام آزمون های t غیر جفت (دو دنباله) استفاده شد.میانگین فیبرهای His-NT2RepCT و NT به ترتیب 11.43 (SD 2.035) و 7.67 (SD 1.389) نانومتر بود.فاصله اطمینان (95%) 246/4- تا 275/3- است.درجه آزادی = 198، p <0.0001.
80 میکرولیتر از نمونه های مایع حاوی 10 میکرومولار تیوفلاوین T (ThT) در سه تکرار (n = 3) تحت شرایط استاتیک با استفاده از صفحات ته شفاف ته سیاه 96 چاهی Corning (Corning Glass 3881، USA) اندازه گیری شد.تفاوت فلورسانس با استفاده از یک فیلتر تحریک 440 نانومتری و یک فیلتر انتشار 480 نانومتری (FLUOStar Galaxy از BMG Labtech، Offenburg، آلمان) ثبت شد.سیگنال ThT نه اشباع و نه خاموش شد، زیرا آزمایش‌هایی با غلظت‌های مختلف ThT بدون تغییر شدت سیگنال انجام شد.جذب را در 360 نانومتر برای اندازه گیری مه ثبت کنید.برای آزمایش بذر، ژل‌های 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تشکیل شد، مجدداً معلق شدند و برای کاشت در نسبت‌های مولی 5، 10 و 20 درصد استفاده شدند.داده ها با استفاده از Prism 9 تجزیه و تحلیل شدند.
ذخایر His-NT2RepCT و NT > 100 میلی گرم بر میلی لیتر را روی یخ ذوب کرده و از طریق یک فیلتر 0.22 میکرومتری فیلتر کنید.غلظت با اندازه گیری جذب در 280 نانومتر با استفاده از نانودراپ محاسبه شد.در چاهک های یک صفحه سیاه 96 چاهی بدون اتصال (Corning) با کف شفاف، نمونه ها تا 20 میلی گرم در میلی لیتر در 20 میلی مولار Tris-HCl pH 8 رقیق شدند و با 5 میکرومولار ThT (غلظت نهایی)، غلظت کل نمونه مخلوط شدند. حجم 50 میکرولیترنمونه‌ها هر 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد روی میکروسکوپ CellObserver (Zeiss) با کانال نور عبوری و مجموعه‌های فیلتر تحریک و نشر FITC برای تصویربرداری ThT تصویربرداری شدند.برای تصویربرداری از یک لنز 20x/0.4 استفاده می شود.برای تجزیه و تحلیل تصویر از Zen Blue (Zeiss) و ImageJ (https://imagej.nih.gov/) استفاده شد.ژل‌ها نیز از محلول‌های NT و His-NT2RepCT در غلظت 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر حاوی 20 میلی‌مولار Tris pH 8 و 5 میکرومولار ThT تهیه و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 دقیقه انکوبه شدند.قطعات ژل به یک چاه جدید حاوی 20 میلی‌مولار تریس، pH 8 و 5 میکرومولار ThT در یک صفحه زیرین شفاف 96 چاهی مشکی غیر الزام آور منتقل شدند.تصاویر فلورسانس سبز و میدان روشن را با بزرگنمایی 20x/0.4 بدست آورید.ImageJ برای تجزیه و تحلیل تصویر استفاده شد.
طیف‌های NMR محلول در 310 کلوین بر روی یک طیف‌سنج Bruker Avance Neo با فرکانس 600 مگاهرتز به‌دست آمدند که مجهز به یک کاوشگر Cryoprobe میدان گرادیان رزونانس چهار قطبی QCI (HFCN) بود.نمونه‌های NMR حاوی 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر پروتئین همگن برچسب‌گذاری شده با 13C، 15N، محلول در 20 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 8)، 0.02% (w/v) NaN3، 5% DO (v/v)، (n = 1) .تغییرات شیمیایی NT2RepCT در pH 6.7 برای تعیین قله 23 در طیف دو بعدی 15N-HSQC استفاده شد.
طیف‌های NMR جامد در حال چرخش با زاویه جادویی (MAS) از هیدروژل‌های 13C و 15N بر روی یک طیف‌سنج Bruker Avance III HD در 800 مگاهرتز مجهز به یک کاوشگر بدون الکترون 3.2 میلی‌متری 13C/15N{1H} ثبت شد.دمای نمونه با استفاده از جریان گاز دمای متغیر در 277 K کنترل شد. طنین دوبعدی دوقطبی رزونانس چرخشی (DARR)76 و اتصال مجدد فرکانس رادیویی (RFDR)77 به ترتیب در فرکانس‌های MAS 12.5 کیلوهرتز و 20 کیلوهرتز به دست آمد.قطبش متقاطع (CP) از 1H تا 13C با استفاده از یک رمپ خطی از 60.0 تا 48.0 کیلوهرتز در 1H، 61.3/71.6 کیلوهرتز در 13C (در 12.5/20 kHz MAS) و زمان تماس 0.5-1 ms انجام شد.در طول جمع آوری داده ها از جداسازی Spinal6478 در 73.5 کیلوهرتز استفاده شد.زمان جذب 10 میلی ثانیه و تاخیر چرخه 2.5 ثانیه بود.همبستگی‌های تک پیوندی Ca/Cβ مشاهده‌شده در طیف‌های RFDR بر اساس تغییرات شیمیایی نوع باقی‌مانده و همبستگی‌های چندگانه در طیف‌های DARR تعیین شدند.
پایگاه داده Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) برای ارزیابی تمایلات فلاتر و انرژی روزتا برای NT، NTFlSp، و NTMiSp استفاده شد.پایگاه داده Zipper Rosetta Energy80 را محاسبه می کند که چندین تابع انرژی آزاد را برای مدل سازی و تجزیه و تحلیل ساختار پروتئین ترکیب می کند.سطح انرژی 23- کیلوکالری در مول یا کمتر نشان دهنده تمایل زیاد به فیبریلاسیون است.انرژی کمتر به معنای پایداری بیشتر دو رشته β در ساختار زیپ است.علاوه بر این، الگوریتم والتز برای پیش‌بینی نواحی آمیلوئیدوژنیک در NT، NTFlSp و NTMiSp استفاده شد.81. (https://waltz.switchlab.org/).
محلول پروتئین NT با بافر 2- (N-morpholino) اتان سولفونیک اسید (MES) در pH 5.5 و 6.0 مخلوط شد تا pH به ترتیب به pH 6 و 7 کاهش یابد.غلظت نهایی پروتئین 100 میلی گرم بر میلی لیتر بود.
اندازه‌گیری‌ها بر روی یک طیف‌سنج J-1500 CD (JASCO، USA) با استفاده از یک کووت 300 میکرولیتری با مسیر نوری 0.1 سانتی‌متر انجام شد.پروتئین ها به 10 میکرومولار (1=n) در بافر فسفات 20 میلی مولار (PH 8) رقیق شدند.برای تجزیه و تحلیل پایداری پروتئین در حضور نمک، پروتئین‌ها با همان غلظت (1=n) در بافر فسفات 20 میلی‌مولار (PH 8) حاوی 154 میلی‌مولار NaF یا NaCl به ترتیب آنالیز شدند.اسکن های دما در 222 نانومتر از 25 درجه سانتی گراد تا 95 درجه سانتی گراد با نرخ گرمایش 1 درجه سانتی گراد در دقیقه ثبت شد.نسبت پروتئین های تا شده بومی با استفاده از فرمول (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal) محاسبه شد.علاوه بر این، پنج طیف برای هر نمونه از 260 نانومتر تا 190 نانومتر در دمای 25 درجه سانتی گراد و پس از حرارت دادن به 95 درجه سانتی گراد ثبت شد.پنج طیف متوسط، صاف و به بیضوی مولی تبدیل شدند.داده ها با استفاده از Prism 9 تجزیه و تحلیل شدند.
شدت فلورسانس His-NT-GFP (300 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، 80 میکرولیتر) در سه تکرار (3 نفر) در صفحات کورنینگ 96 چاهی با کف شفاف سیاه (Corning Glass 3881، USA) تحت شرایط استاتیک اندازه‌گیری شد.نمونه ها را با صفحه خوان مبتنی بر فلورسانس با طول موج تحریک 395 نانومتر اندازه گیری کنید و انتشار را در 509 نانومتر قبل از ژل شدن و 2 ساعت بعد در دمای 37 درجه سانتی گراد ثبت کنید.داده ها با پریسم 9 تجزیه و تحلیل شد.
کیت سنجش فعالیت پورین نوکلئوزید فسفوریلاز (روش فلورومتری سیگما آلدریچ) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد.برای اندازه‌گیری فعالیت در ژل‌ها و محلول‌های حاوی His-NT-PNP، 10 نانوگرم از His-NT-PNP را با 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر NT به حجم 2 میکرولیتر مخلوط کنید، زیرا ژل سیگنالی بالاتر از فاصله تشخیص مجموعه می‌دهد.کنترل برای ژل ها و محلول های بدون His-NT-PNP گنجانده شد.اندازه گیری ها دو بار (n = 2) انجام شد.پس از اندازه گیری فعالیت، مخلوط واکنش برداشته شد و از ژل عکسبرداری شد تا اطمینان حاصل شود که ژل در طول اندازه گیری دست نخورده باقی می ماند.داده ها با استفاده از Prism 9 تجزیه و تحلیل شدند.
برای اطلاعات بیشتر در مورد طراحی مطالعه، چکیده مطالعه طبیعت را که به این مقاله پیوند داده شده است، ببینید.
شکل 1 و 2 داده های اولیه را نشان می دهد.1c، 2a–c، 3a، b، e–g، 4، 5b، d، f، و 6، شکل‌های تکمیلی.3، شکل تکمیلی.5a، d، شکل تکمیلی.6 و شکل تکمیلی8. داده های این مطالعه در پایگاه داده Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 میزبانی می شود.داده های NMR به دست آمده در این مطالعه به مخزن BMRBig تحت شناسه ورودی bmrbig36 ارسال شد.ساختارهای GFP و PNP از PDB (GFP 2B3Q، PNP 4RJ2) گرفته شد.
Rising, A. and Johansson, J. Spinning Artificial Spider Silk.ملی شیمی.زیست شناسی11, 309-315 (2015).
باب، پی ال ​​و همکارانژنوم Nephila clavipes تنوع ژن‌های ابریشم عنکبوت و بیان پیچیده آن‌ها را برجسته می‌کند.ژنت ملی49، 895–903 (2017).