304 جزء شیمیایی لوله سیم پیچ فولادی زنگ نزن، ساختار اکتودومین SPACA6 حاوی یک ابرخانواده حفاظت شده از پروتئین های مرتبط با همجوشی گامت است.

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.شما از یک نسخه مرورگر با پشتیبانی محدود CSS استفاده می کنید.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نشان می‌دهیم.
اسلایدرهایی که سه مقاله را در هر اسلاید نشان می دهند.برای حرکت در اسلایدها از دکمه های پشت و بعدی استفاده کنید یا از دکمه های کنترلر اسلاید در انتها برای حرکت در هر اسلاید استفاده کنید.

SPACA6 یک پروتئین سطحی بیان شده توسط اسپرم است که برای همجوشی گامت در طی تولید مثل جنسی پستانداران حیاتی است.با وجود این نقش اساسی، عملکرد خاص SPACA6 به خوبی درک نشده است.ما ساختار کریستالی حوزه خارج سلولی SPACA6 را با وضوح 2.2 A روشن می‌کنیم و یک پروتئین دو دامنه‌ای متشکل از یک بسته‌بندی چهار رشته‌ای و ساندویچ‌های β-مانند Ig را نشان می‌دهیم که توسط پیوندهای شبه انعطاف‌پذیر به هم متصل شده‌اند.این ساختار شبیه IZUMO1، پروتئین دیگر مرتبط با همجوشی گامت است، که اعضای موسس SPACA6 و IZUMO1 را در خانواده پروتئین های مرتبط با لقاح که در اینجا به عنوان ابرخانواده IST نامیده می شود، می سازد.ابرخانواده IST از نظر ساختاری با بسته‌های پیچ خورده چهار مارپیچ و یک جفت نقوش CXXC مرتبط با دی سولفید تعریف می‌شود.جستجوی AlphaFold مبتنی بر ساختار پروتئوم انسانی، اعضای پروتئینی اضافی این ابرخانواده را شناسایی کرد.به ویژه، بسیاری از این پروتئین ها در همجوشی گامت نقش دارند.ساختار SPACA6 و ارتباط آن با سایر اعضای ابرخانواده IST، حلقه گمشده در دانش ما از همجوشی گامت پستانداران را فراهم می کند.
زندگی هر انسانی با دو گامت هاپلوئید مجزا آغاز می شود: اسپرم پدر و تخمک مادر.این اسپرم برنده یک فرآیند انتخاب شدید است که طی آن میلیون‌ها سلول اسپرم از دستگاه تناسلی زنان عبور می‌کنند، بر موانع مختلف غلبه می‌کنند و تحت ظرفیت قرار می‌گیرند، که باعث افزایش تحرک آنها و فرآیند اجزای سطح می‌شود.حتی اگر اسپرم و تخمک یکدیگر را پیدا کنند، این روند هنوز تمام نشده است.تخمک توسط لایه ای از سلول های کومولوس و یک سد گلیکوپروتئینی به نام زونا پلوسیدا احاطه شده است که اسپرم باید از آن عبور کند تا وارد تخمک شود.اسپرم از ترکیبی از مولکول های چسبنده سطحی و آنزیم های ترشح شده و مرتبط با غشاء برای غلبه بر این موانع نهایی استفاده می کند.این مولکول‌ها و آنزیم‌ها عمدتاً در غشای داخلی و ماتریکس آکروزومی ذخیره می‌شوند و زمانی که غشای بیرونی اسپرم در طی واکنش آکروزومی لیز می‌شود، شناسایی می‌شوند.گام نهایی در این سفر شدید، رویداد همجوشی اسپرم و تخمک است که در آن دو سلول غشاهای خود را به هم می آمیزند تا به یک ارگانیسم واحد دیپلوئید تبدیل شوند.اگرچه این فرآیند در تولید مثل انسان پیشگامانه است، اما تعاملات مولکولی لازم به خوبی درک نشده است.
علاوه بر لقاح گامت ها، شیمی همجوشی دو لایه لیپیدی به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است.به طور کلی، همجوشی غشا یک فرآیند انرژی نامطلوب است که به یک کاتالیزور پروتئینی نیاز دارد تا تحت یک تغییر ساختار ساختاری قرار گیرد که دو غشاء را به هم نزدیک‌تر می‌کند و تداوم آنها را می‌شکند و باعث همجوشی می‌شود.این کاتالیزورهای پروتئینی به عنوان فیوزوژن شناخته می شوند و در سیستم های همجوشی بی شماری یافت شده اند.آن‌ها برای ورود ویروس به سلول‌های میزبان (به عنوان مثال gp160 در HIV-1، سنبله در کروناویروس‌ها، هماگلوتینین در ویروس‌های آنفلوانزا) 10،11،12 جفت (سینسیتین)13،14،15 و همجوشی‌های تشکیل‌دهنده گامت در یوکاریوت‌های پایین‌تر مورد نیاز هستند. HAP2/GCS1 در گیاهان، پروتیست ها و بندپایان) 16،17،18،19.فوزوژن ها برای گامت های انسانی هنوز کشف نشده اند، اگرچه چندین پروتئین برای اتصال و همجوشی گامت ها حیاتی هستند.CD9 بیان شده توسط تخمک، یک پروتئین غشایی مورد نیاز برای ادغام گامت های موش و انسان، اولین چیزی بود که کشف شد 21،22،23.اگرچه عملکرد دقیق آن نامشخص است، نقشی در چسبندگی، ساختار کانون‌های چسبندگی روی میکروویلی‌های تخم‌مرغ، و/یا مکان‌یابی صحیح پروتئین‌های سطح تخمک احتمالاً 24،25،26 است.دو پروتئین معمولی که برای همجوشی گامت حیاتی هستند پروتئین اسپرم IZUMO127 و پروتئین تخمک JUNO28 هستند و ارتباط متقابل آنها گام مهمی در شناخت گامت و چسبندگی قبل از همجوشی است.موش های نر ناک اوت Izumo1 و موش های ماده ناک اوت جونو کاملا استریل هستند، در این مدل ها اسپرم وارد فضای پریویتلین می شود اما گامت ها با هم ترکیب نمی شوند.به طور مشابه، زمانی که گامت ها با آنتی بادی های ضد IZUMO1 یا JUNO27،29 در آزمایش های لقاح آزمایشگاهی انسانی درمان شدند، تلاقی کاهش یافت.
اخیراً، یک گروه تازه کشف شده از پروتئین های بیان شده در اسپرم از نظر فنوتیپی شبیه به IZUMO1 و JUNO20،30،31،32،33،34،35 کشف شده است.پروتئین 6 مرتبط با غشای آکروزوم اسپرم (SPACA6) در یک مطالعه جهش زایی موش در مقیاس بزرگ برای لقاح ضروری شناخته شده است.قرار دادن تراریخته در ژن Spaca6 باعث تولید اسپرم‌های غیرقابل گداخت می‌شود، اگرچه این اسپرم‌ها به فضای پری‌ویتلین نفوذ می‌کنند.مطالعات حذفی بعدی در موش ها تایید کرد که Spaca6 برای همجوشی گامت 30،32 مورد نیاز است.SPACA6 تقریباً منحصراً در بیضه ها بیان می شود و دارای الگوی محلی سازی شبیه به IZUMO1 است، یعنی در داخل انتیما اسپرم قبل از واکنش آکروزومی، و سپس پس از واکنش آکروزومی 30،32 به منطقه استوایی مهاجرت می کند.همولوگ های Spaca6 در انواع پستانداران و سایر یوکاریوت ها وجود دارد و اهمیت آن برای همجوشی گامت های انسانی با مهار لقاح انسانی در شرایط آزمایشگاهی با مقاومت به SPACA6 30 نشان داده شده است.بر خلاف IZUMO1 و JUNO، جزئیات ساختار، تعاملات و عملکرد SPACA6 نامشخص است.
برای درک بهتر فرآیند بنیادی زیربنای ادغام اسپرم و تخمک انسان، که ما را قادر می سازد از پیشرفت های آینده در تنظیم خانواده و درمان باروری مطلع شویم، ما مطالعات ساختاری و بیوشیمیایی SPACA6 را انجام دادیم.ساختار کریستالی دامنه خارج سلولی SPACA6 یک بسته نرم افزاری چهار مارپیچ (4HB) و یک دامنه ایمونوگلوبولین مانند (Ig مانند) را نشان می دهد که توسط مناطق شبه انعطاف پذیر متصل شده اند.همانطور که در مطالعات قبلی پیش بینی شده بود، 7،32،37 ساختار دامنه SPACA6 شبیه به IZUMO1 انسانی است، و این دو پروتئین یک موتیف غیر معمول مشترک دارند: 4HB با سطح مارپیچ مثلثی و یک جفت نقوش CXXC مرتبط با دی سولفید.ما پیشنهاد می‌کنیم که IZUMO1 و SPACA6 اکنون یک ابرخانواده بزرگ‌تر و ساختاری مرتبط از پروتئین‌های مرتبط با همجوشی گامت را تعریف می‌کنند.با استفاده از ویژگی‌های منحصر به‌فرد برای ابرخانواده، ما یک جستجوی جامع برای پروتئوم ساختاری انسان AlphaFold انجام دادیم، اعضای اضافی این ابرخانواده، از جمله چندین عضو درگیر در همجوشی گامت و/یا لقاح.در حال حاضر به نظر می رسد که یک چین ساختاری و یک ابرخانواده پروتئینی در ارتباط با همجوشی گامت وجود دارد و ساختار ما نقشه مولکولی از این جنبه مهم مکانیسم همجوشی گامت انسانی ارائه می دهد.
SPACA6 یک پروتئین گذرنده تک گذر با یک گلیکان متصل به N و شش پیوند دی سولفیدی فرضی است (شکل S1a و S2).ما دامنه خارج سلولی SPACA6 انسانی (بقایای 27-246) را در سلول های مگس سرکه S2 بیان کردیم و پروتئین را با استفاده از میل ترکیبی نیکل، تبادل کاتیونی و کروماتوگرافی حذف اندازه خالص کردیم (شکل S1b).اکتودومین SPACA6 خالص شده بسیار پایدار و همگن است.تجزیه و تحلیل با استفاده از کروماتوگرافی حذف اندازه همراه با پراکندگی نور چند ضلعی (SEC-MALS) یک پیک را با وزن مولکولی محاسبه‌شده 0.5 ± 26.2 کیلو دالتون نشان داد (شکل S1c).این با اندازه اکتودومین مونومر SPACA6 مطابقت دارد، که نشان می‌دهد الیگومریزاسیون در طول تصفیه رخ نداده است.علاوه بر این، طیف‌سنجی دو رنگی دایره‌ای (CD) ساختار مخلوط α/β را با نقطه ذوب 3/51 درجه سانتی‌گراد نشان داد (شکل S1d,e).دکانولوشن طیف CD 38.6 درصد عناصر α-مارپیچ و 15.8 درصد β-رشته را نشان داد (شکل S1d).
اکتودومین SPACA6 با استفاده از ماتریس تصادفی کاشت 38 متبلور شد که منجر به یک مجموعه داده با وضوح 2.2 Å شد (جدول 1 و شکل S3).با استفاده از ترکیبی از جایگزینی مولکولی مبتنی بر قطعه و داده های فازبندی SAD با قرار گرفتن در معرض برمید برای تعیین ساختار (جدول 1 و شکل S4)، مدل نهایی تصفیه شده از باقیمانده های 27-246 تشکیل شده است.در زمان تعیین ساختار، هیچ ساختار آزمایشی یا AlphaFold موجود نبود.اکتودومین SPACA6 دارای ابعاد 20 × 20 × 85 Å است، از هفت مارپیچ و نه رشته β تشکیل شده است و دارای یک چین سوم دراز است که توسط شش پیوند دی سولفیدی تثبیت شده است (شکل 1a, b).چگالی ضعیف الکترون در انتهای زنجیره جانبی Asn243 نشان می دهد که این باقیمانده یک گلیکوزیلاسیون N-پیوند است.ساختار از دو حوزه تشکیل شده است: یک بسته نرم افزاری چهار مارپیچ N-ترمینال (4HB) و یک دامنه Ig مانند ترمینال C با یک منطقه لولای میانی بین آنها (شکل 1c).
ساختار حوزه خارج سلولی SPACA6.نمودار نواری دامنه خارج سلولی SPACA6، رنگ زنجیره از N تا C-پایانه از آبی تیره تا قرمز تیره.سیستئین های دخیل در پیوندهای دی سولفید در سرخابی برجسته می شوند.b توپولوژی حوزه خارج سلولی SPACA6.از طرح رنگی مشابه شکل 1a استفاده کنید.c دامنه خارج سلولی SPACA6.نمودارهای نواری دامنه 4HB، لولا و Ig مانند به ترتیب نارنجی، سبز و آبی هستند.لایه ها به مقیاس کشیده نشده اند.
دامنه 4HB SPACA6 شامل چهار مارپیچ اصلی (مارپیچ 1-4) است که به شکل یک مارپیچ مارپیچ (شکل 2a) مرتب شده اند که به طور متناوب بین برهمکنش های ضد موازی و موازی (شکل 2b) قرار گرفته اند.یک مارپیچ کوچک اضافی تک چرخشی (مارپیچ 1′) عمود بر بسته قرار داده شده است و مثلثی را با مارپیچ های 1 و 2 تشکیل می دهد. شکل 2a).
نمودار نواری ترمینال N 4HB.b نمای بالا دسته ای از چهار مارپیچ که هر مارپیچ با رنگ آبی تیره در انتهای N و قرمز تیره در انتهای C مشخص شده است.c نمودار چرخ مارپیچی بالا به پایین برای 4HB، با هر باقیمانده به صورت دایره ای نشان داده شده با کد اسید آمینه تک حرفی.فقط چهار اسید آمینه در بالای چرخ شماره گذاری شده است.باقیمانده های غیرقطبی زرد رنگ، باقیمانده های قطبی بدون بار به رنگ سبز، باقی مانده های دارای بار مثبت به رنگ آبی و باقی مانده های دارای بار منفی قرمز رنگ هستند.d وجه های مثلثی دامنه 4HB، با 4HB به رنگ نارنجی و لولاها به رنگ سبز.هر دو قسمت دارای پیوندهای دی سولفید میله ای شکل هستند.
4HB روی یک هسته آبگریز درونی متمرکز شده است که عمدتاً از بقایای آلیفاتیک و معطر تشکیل شده است (شکل 2c).هسته حاوی یک پیوند دی سولفیدی بین Cys41 و Cys55 است که مارپیچ های 1 و 2 را در یک مثلث برجسته بالا به هم متصل می کند (شکل 2d).دو پیوند دی سولفیدی اضافی بین موتیف CXXC در مارپیچ 1' و موتیف CXXC دیگری که در نوک گیره موی β در ناحیه لولا یافت می‌شود تشکیل شد (شکل 2d).یک باقیمانده آرژنین محافظه کار با عملکرد ناشناخته (Arg37) در داخل مثلث توخالی که توسط مارپیچ های 1'، 1 و 2 تشکیل شده است، قرار دارد. بین مارپیچ 1' و 1 از طریق برهمکنش بین ستون فقرات Thr32 و زنجیره جانبی (شکل S5a,b).Tyr34 به داخل حفره گسترش می یابد و دو حفره کوچک ایجاد می کند که از طریق آنها Arg37 می تواند با حلال تعامل کند.
دامنه های β-ساندویچ شبه Ig یک ابرخانواده بزرگ از پروتئین ها هستند که ویژگی مشترک دو یا چند ورقه β آمفی پاتیک چند رشته ای دارند که از طریق یک هسته آبگریز در تعامل هستند. و از دو لایه تشکیل شده است (شکل S6a).ورق 1 یک صفحه β از چهار رشته است (رشته‌های D، F، H، و I) که در آن رشته‌های F، H و I یک آرایش ضد موازی تشکیل می‌دهند و رشته‌های I و D برهمکنش موازی دارند.جدول 2 یک صفحه بتای دو رشته ای ضد موازی کوچک (رشته های E و G) است.یک پیوند دی سولفید داخلی بین C-پایانه زنجیره E و مرکز زنجیره H (Cys170-Cys226) مشاهده شد (شکل S6b).این پیوند دی سولفید مشابه پیوند دی سولفید در حوزه β-ساندویچ ایمونوگلوبولین 40،41 است.
ورق β چهار رشته ای در تمام طول خود می پیچد و لبه های نامتقارن را تشکیل می دهد که از نظر شکل و الکترواستاتیک متفاوت هستند.لبه نازکتر یک سطح محیطی آبگریز صاف است که در مقایسه با سطوح ناهموار باقیمانده و دارای تنوع الکترواستاتیکی در SPACA6 متمایز است (شکل S6b,c).هاله ای از گروه های کربونیل/آمینه ستون فقرات در معرض و زنجیره های جانبی قطبی سطح آبگریز را احاطه کرده است (شکل S6c).حاشیه گسترده تر توسط یک بخش مارپیچ درپوش پوشیده شده است که بخش N-ترمینال هسته آبگریز را مسدود می کند و سه پیوند هیدروژنی را با گروه قطبی باز ستون فقرات زنجیره F تشکیل می دهد (شکل S6d).قسمت C ترمینال این لبه یک جیب بزرگ با یک هسته آبگریز تا حدی در معرض تشکیل می دهد.جیب توسط بارهای مثبت به دلیل سه مجموعه باقیمانده آرژنین دوگانه (Arg162-Arg221، Arg201-Arg205 و Arg212-Arg214) و یک هیستیدین مرکزی (His220) احاطه شده است (شکل S6e).
ناحیه لولا یک بخش کوتاه بین دامنه مارپیچ و دامنه Ig مانند است که از یک لایه β سه رشته ای ضد موازی (رشته های A، B و C)، یک مارپیچ کوچک 310 و چندین بخش مارپیچ تصادفی طولانی تشکیل شده است.(شکل S7).به نظر می رسد شبکه ای از تماس های کووالانسی و الکترواستاتیکی در ناحیه لولا، جهت گیری بین 4HB و دامنه Ig مانند را تثبیت می کند.شبکه را می توان به سه بخش تقسیم کرد.بخش اول شامل دو موتیف CXXC (27CXXC30 و 139CXXC142) است که یک جفت پیوند دی سولفیدی بین گیره موی β در لولا و مارپیچ 1' در 4HB تشکیل می‌دهند.بخش دوم شامل برهمکنش های الکترواستاتیکی بین دامنه Ig مانند و لولا است.Glu132 در لولا یک پل نمک با Arg233 در حوزه Ig مانند و Arg135 در لولا تشکیل می دهد.بخش سوم شامل یک پیوند کووالانسی بین دامنه Ig مانند و ناحیه لولا است.دو پیوند دی سولفیدی (Cys124-Cys147 و Cys128-Cys153) حلقه لولا را به پیوندی متصل می کنند که توسط برهمکنش های الکترواستاتیکی بین Gln131 و گروه عملکردی ستون فقرات تثبیت می شود و امکان دسترسی به اولین دامنه Ig مانند را فراهم می کند.زنجیر.
ساختار اکتودومین SPACA6 و ساختارهای مجزا از 4HB و دامنه‌های شبه Ig برای جستجوی رکوردهای ساختاری مشابه در پایگاه‌های داده پروتئین استفاده شد.ما مسابقاتی را با نمرات Dali Z بالا، انحرافات استاندارد کوچک و نمرات LALI بزرگ (که دومی تعداد باقیمانده‌های ساختاری معادل است) شناسایی کردیم.در حالی که 10 بازدید اول از جستجوی کامل اکتودومین (جدول S1) دارای امتیاز Z قابل قبول > 842 بودند، جستجو برای 4HB یا دامنه مشابه Ig به تنهایی نشان داد که بیشتر این بازدیدها فقط با بتا ساندویچ مطابقت دارند.یک چین همه جا در بسیاری از پروتئین ها یافت می شود.هر سه جستجو در دالی تنها یک نتیجه را به همراه داشت: IZUMO1.
مدتهاست که پیشنهاد شده است که SPACA6 و IZUMO1 شباهتهای ساختاری دارند7،32،37.اگرچه اکتودومین های این دو پروتئین مرتبط با همجوشی گامت تنها 21 درصد از هویت توالی مشترک دارند (شکل S8a)، شواهد پیچیده، از جمله یک الگوی پیوند دی سولفیدی حفظ شده و یک دامنه Ig مانند ترمینال C پیش بینی شده در SPACA6، به تلاش های اولیه برای ایجاد یک مدل همسانی یک ماوس SPACA6 با استفاده از IZUMO1 به عنوان یک الگو37.ساختار ما این پیش بینی ها را تایید می کند و درجه واقعی شباهت را نشان می دهد.در واقع، ساختارهای SPACA6 و IZUMO137،43،44 معماری دو دامنه‌ای یکسانی (شکل S8b) با دامنه‌های β-ساندویچ 4HB مشابه و Ig مانند که توسط یک ناحیه لولا متصل شده‌اند به اشتراک می‌گذارند (شکل S8c).
IZUMO1 و SPACA6 4HB تفاوت های مشترکی با بسته های مارپیچی معمولی دارند.4HBهای معمولی، مانند آنهایی که در کمپلکس‌های پروتئینی SNARE درگیر در همجوشی اندوزومی 45،46 یافت می‌شوند، دارای مارپیچ‌هایی با فاصله یکنواخت هستند که انحنای ثابتی را حول محور مرکزی 47 حفظ می‌کنند. در مقابل، حوزه‌های مارپیچ در هر دو IZUMO1 و SPACA6 تحریف شده‌اند، با انحنای متغیر و بسته بندی ناهموار (شکل S8d).پیچش، احتمالاً ناشی از مثلثی است که توسط مارپیچ‌های 1، 1 و 2 تشکیل شده است، در IZUMO1 و SPACA6 حفظ می‌شود و توسط همان موتیف CXXC روی مارپیچ 1 تثبیت می‌شود.با این حال، پیوند دی سولفید اضافی موجود در SPACA6 (Cys41 و Cys55 که مارپیچ‌های 1 و 2 را به صورت کووالانسی به هم پیوند می‌دهند) یک راس تیزتر در راس مثلث ایجاد می‌کند و باعث می‌شود SPACA6 پیچش‌تر از IZUMO1، با مثلث‌های حفره‌ای برجسته‌تر باشد.علاوه بر این، IZUMO1 فاقد Arg37 است که در مرکز این حفره در SPACA6 مشاهده شده است.در مقابل، IZUMO1 دارای یک هسته آبگریز معمولی از بقایای آلیفاتیک و معطر است.
IZUMO1 دارای یک دامنه Ig مانند است که از یک صفحه β دو رشته ای و پنج رشته ای تشکیل شده است.رشته اضافی در IZUMO1 جایگزین سیم پیچ در SPACA6 می شود که با رشته F تعامل می کند تا پیوندهای هیدروژنی ستون فقرات در رشته را محدود کند.یک نقطه مقایسه جالب، بار سطحی پیش بینی شده حوزه های Ig مانند دو پروتئین است.سطح IZUMO1 بار منفی بیشتری نسبت به سطح SPACA6 دارد.یک بار اضافی در نزدیکی C-پایانه رو به غشای اسپرم قرار دارد.در SPACA6، همان نواحی خنثی‌تر یا دارای بار مثبت بودند (شکل S8e).به عنوان مثال، سطح آبگریز (لبه های نازک تر) و گودال های دارای بار مثبت (لبه های پهن تر) در SPACA6 در IZUMO1 بار منفی دارند.
اگرچه رابطه و عناصر ساختار ثانویه بین IZUMO1 و SPACA6 به خوبی حفظ شده است، هم ترازی ساختاری حوزه های Ig مانند نشان داد که این دو حوزه در جهت گیری کلی خود نسبت به یکدیگر متفاوت هستند (شکل S9).بسته مارپیچی IZUMO1 در اطراف ساندویچ β خمیده است و شکل "بومرنگ" را که قبلاً توضیح داده شد در حدود 50 درجه از محور مرکزی ایجاد می کند.در مقابل، پرتو مارپیچ در SPACA6 حدود 10 درجه در جهت مخالف کج شد.تفاوت در این جهت گیری ها احتمالاً به دلیل تفاوت در ناحیه لولا است.در سطح توالی اولیه، IZUMO1 و SPACA6 شباهت کمی در توالی در لولا دارند، به استثنای سیستئین، گلیسین و باقی مانده‌های اسید آسپارتیک.در نتیجه پیوندهای هیدروژنی و شبکه های الکترواستاتیک کاملاً متفاوت هستند.عناصر ساختار ثانویه ورق β توسط IZUMO1 و SPACA6 مشترک هستند، اگرچه زنجیره های IZUMO1 بسیار طولانی تر هستند و مارپیچ 310 (مارپیچ 5) منحصر به فرد SPACA6 است.این تفاوت ها منجر به جهت گیری دامنه های مختلف برای دو پروتئین مشابه می شود.
جستجوی سرور Dali ما نشان داد که SPACA6 و IZUMO1 تنها دو ساختار آزمایشی تعیین شده ذخیره شده در پایگاه داده پروتئین هستند که دارای این تا 4HB خاص هستند (جدول S1).اخیراً، DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold را توسعه داده است، یک سیستم مبتنی بر شبکه عصبی که می تواند ساختارهای سه بعدی پروتئین ها را از توالی های اولیه به دقت پیش بینی کند.مدت کوتاهی پس از حل ساختار SPACA6، پایگاه داده AlphaFold منتشر شد که مدل‌های ساختاری پیش‌بینی‌کننده را ارائه می‌دهد که 98.5 درصد از تمام پروتئین‌های موجود در پروتئوم انسان را پوشش می‌دهد.با استفاده از ساختار SPACA6 حل شده ما به عنوان یک مدل جستجو، یک جستجوی همسانی ساختاری برای مدل در پروتئوم انسانی AlphaFold، نامزدهایی را با شباهت‌های ساختاری احتمالی به SPACA6 و IZUMO1 شناسایی کرد.با توجه به دقت باورنکردنی AlphaFold در پیش‌بینی SPACA6 (شکل S10a) - به‌ویژه اکتودومین 1.1 Å rms در مقایسه با ساختار حل‌شده ما (شکل S10b) - می‌توانیم مطمئن باشیم که مطابقت‌های SPACA6 شناسایی‌شده احتمالاً دقیق هستند.
پیش از این، PSI-BLAST خوشه IZUMO1 را با سه پروتئین دیگر مرتبط با اسپرم جستجو کرد: IZUMO2، IZUMO3 و IZUMO450.AlphaFold پیش‌بینی کرد که این پروتئین‌های خانواده IZUMO با همان الگوی پیوند دی سولفیدی مانند IZUMO1 به دامنه 4HB تا می‌شوند (شکل‌های 3a و S11)، اگرچه فاقد دامنه Ig مانند هستند.فرض بر این است که IZUMO2 و IZUMO3 پروتئین های غشایی یک طرفه شبیه به IZUMO1 هستند، در حالی که به نظر می رسد IZUMO4 ترشح می شود.عملکرد پروتئین های IZUMO 2، 3 و 4 در همجوشی گامت مشخص نشده است.شناخته شده است که IZUMO3 در بیوژنز آکروزوم در طول رشد اسپرم نقش دارد و پروتئین IZUMO یک کمپلکس را تشکیل می دهد.حفاظت از پروتئین های IZUMO در پستانداران، خزندگان و دوزیستان نشان می دهد که عملکرد بالقوه آنها با سایر پروتئین های شناخته شده مرتبط با همجوشی گامت، مانند DCST1/2، SOF1 و FIMP مطابقت دارد.
نمودار معماری دامنه ابرخانواده IST، با دامنه های 4HB، لولا و Ig مانند که به ترتیب با رنگ های نارنجی، سبز و آبی برجسته شده اند.IZUMO4 دارای یک منطقه C ترمینال منحصر به فرد است که سیاه به نظر می رسد.پیوندهای دی سولفیدی تایید شده و فرضی به ترتیب با خطوط توپر و نقطه چین نشان داده می شوند.b IZUMO1 (PDB: 5F4E)، SPACA6، IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1)، IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1)، IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1) و DB: AF-Q1ZYL8-F1).مارپیچ های گذر غشایی TMEM95، IZUMO2 و IZUMO3 نشان داده نشده اند.
برخلاف پروتئین IZUMO، سایر پروتئین های SPACA (یعنی SPACA1، SPACA3، SPACA4، SPACA5 و SPACA9) از نظر ساختاری با SPACA6 متفاوت هستند (شکل S12).فقط SPACA9 دارای 4HB است، اما انتظار نمی رود که جهت گیری موازی-ضد موازی یا همان پیوند دی سولفیدی SPACA6 را داشته باشد.فقط SPACA1 دارای دامنه مشابه Ig است.AlphaFold پیش بینی می کند که SPACA3، SPACA4 و SPACA5 ساختار کاملاً متفاوتی با SPACA6 دارند.جالب توجه است که SPACA4 همچنین نقش مهمی در لقاح دارد، اما به میزان بیشتری نسبت به SPACA6، در عوض تعامل بین اسپرم و تخمک زونا پلوسیدا52 را تسهیل می‌کند.
جستجوی AlphaFold ما مطابقت دیگری برای IZUMO1 و SPACA6 4HB، TMEM95 پیدا کرد.TMEM95، یک پروتئین گذرنده اختصاصی برای اسپرم، موش‌های نر را با قطع کردن 32،33 نابارور می‌کند.اسپرم‌های فاقد TMEM95 دارای مورفولوژی، تحرک و توانایی نفوذ به زونا شفاف و اتصال به غشای تخمک بودند، اما نمی‌توانستند با غشای تخمک ترکیب شوند.مطالعات قبلی نشان داده اند که TMEM95 شباهت های ساختاری با IZUMO133 دارد.در واقع، مدل AlphaFold تأیید کرد که TMEM95 یک 4HB با همان جفت نقوش CXXC مانند IZUMO1 و SPACA6 و همان پیوند دی سولفید اضافی بین مارپیچ‌های 1 و 2 موجود در SPACA6 است (شکل 3a و S11).اگرچه TMEM95 فاقد یک دامنه Ig مانند است، اما دارای ناحیه ای با الگوی پیوند دی سولفیدی شبیه به نواحی لولای SPACA6 و IZUMO1 است (شکل 3b).در زمان انتشار این نسخه خطی، سرور پیش چاپ ساختار TMEM95 را گزارش کرد و نتیجه AlphaFold53 را تأیید کرد.TMEM95 بسیار شبیه به SPACA6 و IZUMO1 است و از نظر تکاملی در حال حاضر در دوزیستان حفظ شده است (شکل 4 و S13).
جستجوی PSI-BLAST از پایگاه های داده NCBI SPACA6، IZUMO1-4، TMEM95، DCST1، DCST2، FIMP و SOF1 برای تعیین موقعیت این توالی ها در درخت زندگی استفاده کرد.فواصل بین نقاط شاخه به مقیاس نشان داده نمی شود.
شباهت ساختاری کلی بین SPACA6 و IZUMO1 نشان می دهد که آنها اعضای بنیانگذار یک ابرخانواده ساختاری حفاظت شده هستند که شامل پروتئین های TMEM95 و IZUMO 2، 3 و 4 است.اعضای شناخته شده: IZUMO1، SPACA6 و TMEM95.از آنجایی که تنها تعداد کمی از اعضا دارای دامنه‌های Ig مانند هستند، علامت بارز ابرخانواده IST دامنه 4HB است که دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی است که در همه این پروتئین‌ها مشترک است: 1) 4HB پیچ‌دار با مارپیچ‌هایی که در یک تناوب ضد موازی/موازی چیده شده‌اند (شکل . 5a)، 2) دسته دارای یک صورت مثلثی است که از دو مارپیچ در داخل بسته و یک مارپیچ عمودی سوم تشکیل شده است (شکل ناحیه کلیدی (شکل 5c). نقش موتیف CXXC که در پروتئین های شبه تیوردوکسین یافت می شود، شناخته شده است که عمل می کند. به عنوان یک حسگر ردوکس 54،55،56، در حالی که موتیف در اعضای خانواده IST می تواند با ایزومرازهای دی سولفید پروتئینی مانند ERp57 در همجوشی گامت مرتبط باشد.
اعضای ابرخانواده IST با سه ویژگی مشخصه حوزه 4HB تعریف می‌شوند: چهار مارپیچ متناوب بین جهت‌گیری موازی و ضد موازی، صورت‌های مارپیچ مثلثی شکل ba، و یک موتیف دوگانه ca CXXC که بین مولکول‌های کوچک تشکیل شده است.) مارپیچ N ترمینال (نارنجی) و ناحیه لولای β-پیچ مویی (سبز).
با توجه به شباهت بین SPACA6 و IZUMO1، توانایی اولی برای اتصال به IZUMO1 یا JUNO مورد آزمایش قرار گرفت.تداخل سنجی لایه ای (BLI) یک روش اتصال مبتنی بر جنبشی است که قبلاً برای تعیین کمیت تعامل بین IZUMO1 و JUNO استفاده شده است.پس از انکوباسیون حسگر نشاندار شده با بیوتین با IZUMO1 به عنوان طعمه با غلظت بالایی از آنالیت JUNO، یک سیگنال قوی شناسایی شد (شکل S14a)، که نشان دهنده تغییر ناشی از اتصال در ضخامت ماده زیستی متصل به نوک حسگر است.سیگنال های مشابه (یعنی JUNO به عنوان طعمه در برابر آنالیت IZUMO1 به سنسور کوپل شده است) (شکل S14b).هنگامی که SPACA6 به عنوان یک آنالیت در برابر IZUMO1 متصل به حسگر یا JUNO محدود به سنسور استفاده شد، سیگنالی شناسایی نشد (شکل S14a,b).عدم وجود این سیگنال نشان می دهد که دامنه خارج سلولی SPACA6 با دامنه خارج سلولی IZUMO1 یا JUNO تعامل ندارد.
از آنجایی که سنجش BLI مبتنی بر بیوتینیلاسیون بقایای لیزین آزاد بر روی پروتئین طعمه است، اگر بقایای لیزین در برهمکنش نقش داشته باشند، این اصلاح می تواند از اتصال جلوگیری کند.علاوه بر این، جهت اتصال نسبت به حسگر می‌تواند موانع فضایی ایجاد کند، بنابراین سنجش‌های pull-down معمولی نیز روی اکتودومین‌های نوترکیب SPACA6، IZUMO1 و JUNO انجام شد.با وجود این، SPACA6 با IZUMO1 دارای برچسب His یا JUNO دارای برچسب His (شکل S14c،d) رسوب نکرد، که نشان می‌دهد هیچ تعاملی مطابق با آنچه در آزمایش‌های BLI مشاهده شد وجود ندارد.به عنوان یک کنترل مثبت، ما تعامل JUNO با IZUMO1 نشاندار شده را تایید کردیم (شکل S14e و S15).
با وجود شباهت ساختاری بین SPACA6 و IZUMO1، ناتوانی SPACA6 در اتصال JUNO تعجب آور نیست.سطح IZUMO1 انسانی دارای بیش از 20 باقیمانده است که با JUNO تعامل دارند، از جمله بقایای هر یک از سه ناحیه (اگرچه بیشتر آنها در ناحیه لولا قرار دارند) (شکل S14f).از این باقیمانده ها، تنها یکی در SPACA6 (Glu70) حفظ شده است.در حالی که بسیاری از جایگزین های باقی مانده خواص بیوشیمیایی اصلی خود را حفظ کردند، باقی مانده Arg160 ضروری در IZUMO1 با Asp148 با بار منفی در SPACA6 جایگزین شد.مطالعات قبلی نشان داده اند که جهش Arg160Glu در IZUMO1 تقریباً به طور کامل اتصال به JUNO43 را از بین می برد.علاوه بر این، تفاوت در جهت گیری دامنه بین IZUMO1 و SPACA6 به طور قابل توجهی مساحت سطح محل اتصال JUNO ناحیه معادل در SPACA6 را افزایش داد (شکل S14g).
علیرغم نیاز شناخته شده به SPACA6 برای همجوشی گامت و شباهت آن به IZUMO1، به نظر نمی رسد که SPACA6 عملکرد اتصال JUNO معادلی داشته باشد.بنابراین، ما به دنبال ترکیب داده های ساختاری خود با شواهدی از اهمیت ارائه شده توسط زیست شناسی تکاملی بوده ایم.تراز توالی همولوگ های SPACA6 حفظ ساختار مشترک فراتر از پستانداران را نشان می دهد.برای مثال، بقایای سیستئین حتی در دوزیستان دوردست نیز وجود دارد (شکل 6a).با استفاده از سرور ConSurf، داده های حفظ تراز توالی چندگانه از 66 دنباله به سطح SPACA6 نگاشت شدند.این نوع تجزیه و تحلیل می تواند نشان دهد که کدام باقی مانده ها در طول تکامل پروتئین حفظ شده اند و می تواند نشان دهد که کدام مناطق سطحی در عملکرد نقش دارند.
تراز توالی اکتودومین SPACA6 از 12 گونه مختلف تهیه شده با استفاده از CLUSTAL OMEGA.بر اساس تحلیل ConSurf، محافظه کارانه ترین موقعیت ها با رنگ آبی مشخص شده اند.باقی مانده های سیستئین با رنگ قرمز مشخص شده اند.مرزهای دامنه و عناصر ساختار ثانویه در بالای تراز نشان داده شده اند، جایی که فلش ها رشته های β و امواج نشان دهنده مارپیچ ها هستند.شناسه‌های دسترسی NCBI حاوی توالی‌ها عبارتند از: انسان (Homo sapiens، NP_001303901)، ماندریل (Mandrilus leucophaeus، XP_011821277)، میمون کاپوچین (Cebus mimic، XP_017359360، XP_01735930366)، XP_01735930366، XP_01735930366، XP_01735930366، XP_01735930366، XP_01735930366، XP_01735930366، XP_01735930306، Orcinus orca3_23 XP_032_034).)، گوسفند (Ovis aries، XP_014955560)، فیل (Loxodonta africana، XP_010585293)، سگ (Canis lupus familyis، XP_025277208)، موش (Mus musculus، NP_001156manianph81)، ، XP_0318)، Platypus، 8) ، 61_89 و Bullfrog (Bufo bufo، XP_040282113).شماره گذاری بر اساس نظم انسانی است.b نمایش سطحی ساختار SPACA6 با 4HB در بالا و دامنه Ig مانند در پایین، رنگ‌ها بر اساس تخمین‌های حفاظت از سرور ConSurf.بهترین قسمت های حفظ شده به رنگ آبی، قسمت های نسبتاً حفظ شده به رنگ سفید و کمترین حفظ شده در رنگ زرد هستند.سیستئین بنفشسه وصله سطحی که سطح بالایی از محافظت را نشان می‌دهند در تکه‌های 1، 2 و 3 درونی نشان داده شده‌اند. یک کارتون 4HB در قسمت بالا سمت راست نشان داده شده است (طرح رنگی مشابه).
ساختار SPACA6 دارای سه ناحیه سطحی بسیار حفاظت شده است (شکل 6b).پچ 1 4HB و ناحیه لولا را پوشش می دهد و شامل دو پل دی سولفید CXXC حفاظت شده، یک شبکه لولای Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (شکل S7)، و سه باقیمانده آروماتیک بیرونی حفظ شده (Phe31، Tyr73، Phe137) است.لبه وسیع تری از دامنه Ig مانند (شکل S6e)، که نشان دهنده چندین باقی مانده با بار مثبت روی سطح اسپرم است.جالب اینجاست که این پچ حاوی یک اپی توپ آنتی بادی است که قبلاً نشان داده شده بود با عملکرد SPACA6 30 تداخل دارد.منطقه 3 لولا و یک طرف دامنه Ig مانند را در بر می گیرد.این منطقه حاوی پرولین های حفاظت شده (Pro126، Pro127، Pro150، Pro154) و باقی مانده های قطبی / باردار رو به بیرون است.با کمال تعجب، بیشتر باقیمانده‌های روی سطح 4HB بسیار متغیر هستند (شکل 6b)، اگرچه چین‌خوردگی در سراسر همولوگ SPACA6 (همانطور که توسط محافظه‌کاری هسته بسته‌های آبگریز نشان داده می‌شود) و فراتر از ابرخانواده IST حفظ می‌شود.
اگرچه این کوچکترین منطقه در SPACA6 با کمترین عناصر ساختاری ثانویه قابل تشخیص است، بسیاری از بقایای ناحیه لولا (از جمله منطقه 3) در بین همولوگهای SPACA6 بسیار حفظ شده اند، که ممکن است نشان دهنده این باشد که جهت بسته مارپیچی و β-ساندویچ نقش دارند.به عنوان یک محافظه کاربا این حال، با وجود پیوند هیدروژنی و شبکه های الکترواستاتیک گسترده در ناحیه لولا SPACA6 و IZUMO1، شواهدی از انعطاف پذیری ذاتی را می توان در تراز ساختارهای مجاز متعدد IZUMO137،43،44 مشاهده کرد.هم‌ترازی حوزه‌های جداگانه به خوبی همپوشانی دارند، اما جهت‌گیری دامنه‌ها نسبت به یکدیگر از 50 درجه تا 70 درجه از محور مرکزی متفاوت است (شکل S16).برای درک دینامیک ساختاری SPACA6 در محلول، آزمایش‌های SAXS انجام شد (شکل S17a،b).بازسازی اولیه اکتودومین SPACA6 با ساختار کریستالی میله ای مطابقت داشت (شکل S18)، اگرچه نمودار کراتکی درجاتی از انعطاف پذیری را نشان داد (شکل S17b).این ترکیب با IZUMO1 در تضاد است، که در آن پروتئین بی‌پیوند هم در شبکه و هم در محلول شکل بومرنگی به خود می‌گیرد.
برای شناسایی خاص منطقه انعطاف پذیر، طیف سنجی جرمی تبادل هیدروژن-دوتریوم (H-DXMS) بر روی SPACA6 انجام شد و با داده هایی که قبلاً در IZUMO143 به دست آمده بود مقایسه شد (شکل 7a,b).SPACA6 به وضوح انعطاف پذیرتر از IZUMO1 است، همانطور که با تبادل دوتریوم بالاتر در سراسر ساختار پس از 100000 ثانیه مبادله نشان می دهد.در هر دو ساختار، قسمت C ترمینال ناحیه لولا سطح بالایی از تبادل را نشان می‌دهد، که احتمالاً امکان چرخش محدود دامنه‌های 4HB و Ig مانند را نسبت به یکدیگر می‌دهد.جالب توجه است، قسمت C ترمینال لولا SPACA6، متشکل از باقیمانده 147CDLPLDCP154، یک منطقه بسیار حفاظت شده 3 است (شکل 6b)، که احتمالاً نشان می دهد که انعطاف پذیری بین دامنه ای یک ویژگی تکاملی حفاظت شده SPACA6 است.با توجه به تجزیه و تحلیل انعطاف پذیری، داده های مذاب حرارتی CD نشان داد که SPACA6 (Tm = 51.2 درجه سانتی گراد) پایداری کمتری نسبت به IZUMO1 (Tm = 62.9 درجه سانتی گراد) دارد (شکل S1e و S19).
تصاویر H-DXMS از SPACA6 و b IZUMO1.درصد تبادل دوتریوم در نقاط زمانی مشخص شده تعیین شد.سطوح تبادل هیدروژن-دوتریوم با رنگ در مقیاس گرادیان از آبی (10٪) تا قرمز (90٪) نشان داده می شود.جعبه‌های سیاه نشان‌دهنده مناطقی هستند که تبادل بالایی دارند.مرزهای 4HB، لولا و دامنه Ig مانند مشاهده شده در ساختار کریستالی در بالای توالی اولیه نشان داده شده است.سطوح تبادل دوتریوم در 10 ثانیه، 1000 ثانیه و 100،000 ثانیه بر روی نمودار نواری که بر روی سطوح مولکولی شفاف SPACA6 و IZUMO1 قرار گرفته است، رسم شد.قسمت هایی از ساختارها با سطح تبادل دوتریوم زیر 50 درصد به رنگ سفید هستند.نواحی بالای 50% تبادل H-DXMS در مقیاس گرادیان رنگ می شوند.
استفاده از CRISPR/Cas9 و استراتژی های ژنتیکی حذف ژن موش منجر به شناسایی چندین عامل مهم برای اتصال و همجوشی اسپرم و تخمک شده است.جدای از برهمکنش به خوبی مشخص شده ساختار IZUMO1-JUNO و CD9، بیشتر پروتئین های مرتبط با همجوشی گامت از نظر ساختاری و عملکردی مبهم باقی می مانند.خصوصیات بیوفیزیکی و ساختاری SPACA6 قطعه دیگری از پازل مولکولی چسبندگی/همجوشی در طول لقاح است.
به نظر می رسد SPACA6 و سایر اعضای ابرخانواده IST در پستانداران و همچنین پرندگان، خزندگان و دوزیستان به شدت حفاظت شده باشند.در واقع، تصور می شود که SPACA6 حتی برای لقاح در گورخرماهی 59 مورد نیاز است. این توزیع مشابه سایر پروتئین های مرتبط با همجوشی گامت های شناخته شده مانند DCST134، DCST234، FIMP31 و SOF132 است که نشان می دهد این عوامل دارای کمبود HAP2 هستند (همچنین). GCS1) پروتئین هایی که مسئول فعالیت کاتالیزوری بسیاری از پروتیست ها هستند.، گیاهان و بندپایان.پروتئین‌های همجوشی بارور شده 60، 61. علی‌رغم شباهت ساختاری قوی بین SPACA6 و IZUMO1، حذف ژن‌های کدکننده هر یک از این پروتئین‌ها منجر به ناباروری در موش‌های نر شد، که نشان می‌دهد عملکرد آنها در همجوشی گامت‌ها تکراری نیست..به طور گسترده تر، هیچ یک از پروتئین های شناخته شده اسپرم مورد نیاز برای مرحله چسبندگی همجوشی اضافی نیست.
این یک سوال باز باقی می ماند که آیا SPACA6 (و سایر اعضای ابرخانواده IST) در پیوندهای بین گیمی شرکت می کنند، شبکه های درون گامی را برای جذب پروتئین های مهم به نقاط همجوشی تشکیل می دهند یا شاید حتی به عنوان ترکیبات گریزان عمل کنند.مطالعات هم‌رسوبی ایمنی در سلول‌های HEK293T برهمکنش بین IZUMO1 تمام طول و SPACA632 را نشان داد.با این حال، اکتودومین‌های نوترکیب ما در شرایط آزمایشگاهی برهم‌کنش نداشتند، که نشان می‌دهد برهمکنش‌هایی که در Noda و همکاران مشاهده می‌شود.هر دو در ساختار حذف شدند (به دم سیتوپلاسمی IZUMO1 توجه داشته باشید که نشان داده شده است که برای لقاح غیر ضروری است62).از طرف دیگر، IZUMO1 و/یا SPACA6 ممکن است به محیط‌های اتصال خاصی نیاز داشته باشند که در شرایط آزمایشگاهی آن‌ها را بازتولید نمی‌کنیم، مانند ترکیب‌های خاص فیزیولوژیکی یا کمپلکس‌های مولکولی حاوی پروتئین‌های دیگر (معروف یا هنوز کشف نشده).اگرچه اعتقاد بر این است که اکتودومین IZUMO1 واسطه اتصال اسپرم به تخمک در فضای پریویتلین است، هدف از اکتودومین SPACA6 نامشخص است.
ساختار SPACA6 چندین سطح حفاظت شده را نشان می دهد که ممکن است در تعاملات پروتئین-پروتئین دخیل باشند.بخش حفاظت شده از ناحیه لولا بلافاصله مجاور موتیف CXXC (که در قسمت 1 در بالا مشخص شده است) دارای چندین بقایای معطر رو به بیرون است که اغلب با برهمکنش‌های آبگریز و انباشته‌ای π بین مولکول‌های زیستی مرتبط هستند.اضلاع پهن دامنه Ig مانند (منطقه 2) یک شیار با بار مثبت با Arg و باقیمانده های او بسیار محافظت شده را تشکیل می دهد و آنتی بادی ها علیه این ناحیه قبلاً برای جلوگیری از همجوشی گامت استفاده شده است.آنتی بادی اپی توپ خطی 212RIRPAQLTHRGTFS225 را تشخیص می دهد که دارای سه مورد از شش باقی مانده آرژنین و His220 بسیار حفاظت شده است.مشخص نیست که آیا این اختلال به دلیل انسداد این بقایای خاص است یا کل منطقه.محل این شکاف در نزدیکی انتهای C بتا ساندویچ نشان دهنده برهمکنش سیس با پروتئین های اسپرم همسایه است، اما نه با پروتئین های تخمک.علاوه بر این، حفظ یک درهم پیچیده پرولین بسیار انعطاف پذیر (محل 3) در لولا ممکن است محل تعامل پروتئین-پروتئین باشد یا به احتمال زیاد نشان دهنده حفظ انعطاف پذیری بین دو حوزه باشد.جنسیت برای نقش ناشناخته SPACA6 مهم است.ادغام گامت ها
SPACA6 دارای خواص پروتئین های چسبنده بین سلولی از جمله بتا ساندویچ های Ig مانند است.بسیاری از پروتئین‌های چسبنده (مانند کادرین‌ها، اینتگرین‌ها، آدهزین‌ها و IZUMO1) دارای یک یا چند حوزه بتا ساندویچ هستند که پروتئین‌ها را از غشای سلولی به اهداف محیطی خود گسترش می‌دهند.دامنه Ig مانند SPACA6 همچنین حاوی یک موتیف است که معمولاً در بتا ساندویچ‌های چسبندگی و چسبندگی یافت می‌شود: دوتایی از رشته‌های موازی در انتهای ساندویچ‌های β، که به گیره‌های مکانیکی معروف هستند.اعتقاد بر این است که این موتیف مقاومت در برابر نیروهای برشی را افزایش می دهد که برای پروتئین های دخیل در فعل و انفعالات بین سلولی ارزشمند است.با این حال، با وجود این شباهت به چسبان، در حال حاضر هیچ مدرکی مبنی بر تعامل SPACA6 با سفیده تخم مرغ وجود ندارد.اکتودومین SPACA6 قادر به اتصال به JUNO نیست و سلول های HEK293T بیان کننده SPACA6، همانطور که در اینجا نشان داده شده است، به سختی با تخمک های فاقد زونا 32 تعامل دارند.اگر SPACA6 پیوندهای بین گامی ایجاد کند، این فعل و انفعالات ممکن است نیاز به تغییرات پس از ترجمه داشته باشند یا توسط پروتئین های دیگر اسپرم تثبیت شوند.در حمایت از فرضیه دوم، اسپرم‌های دارای کمبود IZUMO1 به تخمک‌ها متصل می‌شوند و نشان می‌دهند که مولکول‌هایی غیر از IZUMO1 در مرحله 27 چسبندگی گامت دخیل هستند.
بسیاری از پروتئین‌های همجوشی ویروسی، سلولی و تکاملی دارای خواصی هستند که عملکرد آنها را به‌عنوان فیوزوژن پیش‌بینی می‌کند.به عنوان مثال، گلیکوپروتئین های همجوشی ویروسی (کلاس های I، II و III) دارای یک پپتید یا حلقه همجوشی آبگریز در انتهای پروتئین هستند که به غشای میزبان وارد می شود.نقشه آب دوستی IZUMO143 و ساختار (تعیین شده و پیش‌بینی شده) ابرخانواده IST هیچ پپتید همجوشی آبگریز ظاهری را نشان نداد.بنابراین، اگر پروتئین‌های موجود در ابرخانواده IST به‌عنوان ذوب‌زا عمل کنند، به روشی متفاوت از سایر نمونه‌های شناخته‌شده عمل می‌کنند.
در نتیجه، عملکرد اعضای ابرخانواده پروتئین های IST مرتبط با همجوشی گامت یک راز وسوسه انگیز باقی مانده است.مولکول نوترکیب SPACA6 مشخص شده ما و ساختار حل شده آن بینشی در مورد روابط بین این ساختارهای مشترک و نقش آنها در اتصال و همجوشی گامت ارائه می دهد.
توالی DNA مربوط به اکتودومین SPACA6 انسانی پیش‌بینی‌شده (شماره دسترسی NCBI NP_001303901.1؛ باقی‌مانده‌های 27-246) برای بیان در سلول‌های Drosophila melanogaster S2 با کدون بهینه‌سازی شد و به‌عنوان یک ژن با توالی GenicsE Encoding قطعه‌سازی شد.سیگنال ترشح BiP و انتهای 5' و 3' مربوطه برای شبیه سازی مستقل از بستن این ژن به یک وکتور بیان pMT بر اساس یک پروموتر متالوتیونین اصلاح شده برای انتخاب با پورومایسین (pMT-puro).وکتور pMT-puro یک محل برش ترومبین و به دنبال آن یک برچسب C ترمینال 10x-His را کد می کند (شکل S2).
انتقال پایدار وکتور SPACA6 pMT-puro به سلول‌های D. melanogaster S2 (Gibco) مشابه پروتکل مورد استفاده برای IZUMO1 و JUNO43 انجام شد.سلول های S2 ذوب شده و در محیط اشنایدر (Gibco) با غلظت نهایی 10% (v/v) سرم جنین گوساله غیرفعال شده با حرارت (Gibco) و آنتی بیوتیک ضد قارچ 1X (Gibco) رشد کردند.سلول های گذر اولیه (3.0 در 106 سلول) در چاهک های جداگانه صفحات 6 چاهی (Corning) قرار گرفتند.پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 27 درجه سانتی گراد، سلول ها با مخلوطی از 2 میلی گرم از وکتور SPACA6 pMT-puro و معرف ترانسفکشن Effectene (Qiagen) طبق پروتکل سازنده ترانسفکت شدند.سلول های ترانسفکت شده به مدت 72 ساعت انکوبه شدند و سپس با 6 میلی گرم در میلی لیتر پورومایسین برداشت شدند.سپس سلول ها از محیط کامل اشنایدر جداسازی و در محیط بدون سرم Insect-XPRESS (Lonza) برای تولید پروتئین در مقیاس بزرگ قرار داده شدند.یک دسته 1 لیتری از کشت سلولی S2 به سلول های 8-10 × 106 ml-1 در یک فلاسک ارلن مایر پلی پروپیلن با کف مسطح تهویه شده 2 لیتری رشد داده شد و سپس با غلظت نهایی 500 میکرومولار CuSO4 (میلی پور سیگما) استریل شد و فیلتر استریل شد.القاء شده.کشت های القا شده در دمای 27 درجه سانتی گراد با سرعت 120 دور در دقیقه به مدت چهار روز انکوبه شدند.
محیط تهویه شده حاوی SPACA6 با سانتریفیوژ در 5660 × گرم در دمای 4 درجه سانتی گراد و به دنبال آن یک سیستم فیلتراسیون جریان مماسی Centramate (Pall Corp) با یک غشای 10 کیلو دالتون MWCO جدا شد.محیط غلیظ حاوی SPACA6 را روی ستون 2 میلی لیتری Ni-NTA آگارز (Qiagen) قرار دهید.رزین Ni-NTA با 10 حجم ستون (CV) بافر A شسته شد و سپس 1 CV از بافر A به غلظت نهایی ایمیدازول 50 میلی مولار اضافه شد.SPACA6 با 10 میلی لیتر بافر A همراه با ایمیدازول تا غلظت نهایی 500 میلی مولار شستشو داده شد.ترومبین کلاس محدود (میلیپور سیگما) به طور مستقیم به لوله دیالیز (MWCO 12-14 کیلو دالتون) با 1 واحد در هر میلی گرم SPACA6 در مقابل 1 لیتر 10 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5 و 150 میلی مولار NaCl (بافر B) برای دیالیز اضافه شد.) در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت.سپس SPACA6 شکسته شده با ترومبین سه برابر رقیق شد تا غلظت نمک کاهش یابد و بر روی یک ستون تبادل کاتیونی 1 میلی لیتری MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) که با 10 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5 متعادل شده بود، بارگذاری شد.مبدل کاتیونی با 3 CV 10 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5 شسته شد، سپس SPACA6 با گرادیان خطی 0 تا 500 میلی مولار NaCl در 10 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5 برای 25 CV شسته شد.پس از کروماتوگرافی تبادل یونی، SPACA6 به 1 میلی لیتر تغلیظ شد و به صورت ایزوکراتیک از یک ستون ENrich SEC650 10×300 (BioRad) متعادل شده با بافر B. با توجه به کروماتوگرام، استخر و فراکسیون های کنسانتره حاوی SPACA6 شسته شد.خلوص با الکتروفورز رنگ آمیزی شده با کوماسی روی ژل 16% SDS-پلی آکریل آمید کنترل شد.غلظت پروتئین با جذب در 280 نانومتر با استفاده از قانون بیر-لامبرت و ضریب انقراض مولی نظری تعیین شد.
SPACA6 خالص شده یک شبه در برابر 10 میلی مولار فسفات سدیم، pH 7.4 و 150 میلی‌مولار NaF دیالیز شد و قبل از آنالیز با طیف‌سنجی CD تا 0.16 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر رقیق شد.اسکن طیفی CDها با طول موج 185 تا 260 نانومتر بر روی طیف‌سنج Jasco J-1500 با استفاده از کووت‌های کوارتز با طول مسیر نوری 1 میلی‌متر (هلما) در دمای 25 درجه سانتی‌گراد با سرعت 50 نانومتر بر دقیقه جمع‌آوری شد.طیف CD خط پایه تصحیح شد، میانگین بیش از 10 اکتساب، و تبدیل به میانگین بیضوی باقیمانده (θMRE) بر حسب سانتی‌متر 2/dmol شد:
که در آن MW وزن مولکولی هر نمونه در Da است.N تعداد اسیدهای آمینه است.θ بیضی بودن بر حسب میلی درجه است.d مربوط به طول مسیر نوری بر حسب سانتی متر است.غلظت پروتئین در واحد